沼泽红假单胞菌的分类鉴定和生理特性

沼泽红假单胞菌的分类鉴定和生理特性摘要采用改良的Hungate厌氧培养技术一滚管法,从淀粉厂的污泥中,分离得到一株革兰氏阴性,弯曲杆状,出芽繁殖,既能在光照厌氧,也能在黑暗好氧条件下生活的光能异养型Y6菌株.经形态观察、生理特性的测定,确证Y6菌株为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudpmonaspalustris).关键词:紫色非硫光合细菌,沼泽红假单胞菌,厌氧培养技术利用光合细菌净化高浓度有机废水,己是废水生物处理法中的一个重要方法.它具有有机负荷高,占地面积小,投资费用少,动力消耗低,除氮效果好和耐盐能力强等优点.同时,产生的菌体污泥是优质的饲料和肥料,可加以综合利用.因此,近几年来用光合细菌法(PSB)净化废水正受到人们的广泛重视.目前,用于有机废水净化的光合细菌,主要是紫色非硫细菌红螺菌科(Rhodo‘Pi({llaceac)的一些菌株·这些菌一般均为兼性光合细菌·应用于有机废水净化的菌株,要求对有机质有较强的代谢能力和较高的耐受性,对不良环境因素,如温度、pH和盐度等有较强的适应性.为了进一步开展紫色非硫细菌在净化有机废水中的应用研究,我们从淀粉厂污泥中分离到一株光能异养型Y6菌株.经初步测试,表明具有利用基质广泛、生长速度快、耐受有机质浓度较高等特点.经鉴定确认,Y‘菌株为沼泽红假单胞菌(Rhodo脾udomonas尸alustr哟.现将分离鉴定结果和某些生理特性报导如下.材料和方法.1菌株来源Y6菌株从济南市槐荫区淀粉厂污水排放沟污泥中分离获得..2培养基vanNiel培养基〔‘〕Molisch琼脂培养基〔2〕YP琼脂培养基〔,〕RCVBN培养基〔3〕,3菌种分离和纯化*收稿口期:1990一l!一16第3期于温旭等:紫色非硫光合细菌的研究·345·取污泥样品在VanNiel培养基中富集培养,30℃,Zo00Lx光照厌氧培养3一4天后,培养基呈绛红色.再经4次连续转接培养,使光合细菌的生长在富集液中占绝对优势,然后采用改良Hungat。厌氧培养技术一注滚管法闭进行分离纯化.待长出单个红色菌落后挑取菌落穿刺接人Molish琼脂杜内保存,或再用YP培养基平板反复划线分离,取得纯培养物.1.4碳源和电子供体、氨基酸利用试验在每支装有sml琼脂基础培养基试管中分别加人0.2%浓度的各种碳源和电子供体:或在每支装有sml不含氮源的基础培养基试管中,分别加人0.01%浓度的各类氨基酸.试验均采用穿刺法,并置于28℃,1000Lx厌氧光照培养3天.1.5完整菌体和离体光合色素吸收光谱的检测活细胞吸收光谱测定,用60%蔗糖溶液制成菌体悬液:离体光合色素吸收光谱测定,以超声波碎破,得红色无细胞抽提液.均用Uv一240型分光光度计扫描,波长范围300~900nm.1.‘生长曲线的测定分别在厌氧和微好氧(120r/min)条件下,以RcvBN液体培养基接种2%菌液,28℃,1000Lx光照培养,定时在680nm处测定o.D值,绘制生长曲线,由生长曲线可得出菌的倍增时间.1.7酵母膏对菌体生长的影响用不同浓度酵一母膏代替生长因子,定期在68onm处测定OD值,并于培养48h后离心、烘干称重计算菌休得率.1.8菌体对乙酸钠和谷氨酸钠的耐受性试验以不同浓度的乙酸钠溶液代替RCVBN培养基中的苹果酸为碳源:或以不同浓度的谷氨酸钠为RCVBN培养基中的氮源,均置于28℃,Z000Lx厌氧光照培养,定时测定680nm处0.D值.1.9菌种鉴定方法主要根据Borgcy氏“细菌鉴定手册’夕第八版〔’〕,以及有关文献〔‘,’〕进行.,冷二卜甲…山二目刁、2.1形态特征纯培养物菌株Y‘为革兰氏阴性反应.细胞呈杆状,稍有弯曲,形态多变,大小不均(图l),菌体大小为0.7一0.9X1.1一2.6拼m,有极生或亚极生单鞭毛(图2).出芽繁殖,先在鞭毛着生相对端膨大,使细胞呈哑铃状,然后形成芽体,与原菌体分离.老龄菌体聚集,常呈玫瑰花饰状(图3).2.2拾养特征菌株Y6在光照厌氧条件下生长很快.在RCvBN培养液中,初期菌液呈红色至鲜红色,后期转为红褐色,老培养物形成均质易扩散的沉淀;在RCVBN琼脂斜面上,菌落圆而小,呈鲜红至暗红.在黑暗好氧条件下,用YP培养基平板培养时,生长旺盛,菌苔明亮,无色至鲜红色.·346·山东大学学报〔自然科学版)第26卷2.3碳源和电子供体、氨基酸的利用试验结果表明,Y。菌株对碳源的利用较为广泛.许多有机物都可作为碳源,且以乙酸钠、丁酸钠、甘油、丙酮酸和苹果酸等对生长更为有刊(表l):氮源试验证明,谷氨酸钠和丙氨酸对菌体生长有促进作用(表2).表1Y6菌株对碳源和电子供体的利用Table1Utilizationofearbonsoureesandeleetrondonorsbyy‘strain碳源或电子供体CarbonsoureeoreleetrondonorY6菌株Y6strain甲酸钠(Sbdiumformate)乙酸钠(Sodiumaeetate)丙酸钠(Sodi笋mpropionat。)丁酸钠(sobiumbutgrate)甲醇(Mathanol)乙醇(Ethanol)甘油(olycerol)葡萄糖(oxueose)果糖(Fruetose)甘露醇(Mannitol)’山梨醇(Sorbitol)苯甲酸钠(sodiumben,oate)丙酮酸(Pyruvicaeid)珑拍酸钠(Sodiumsueeinate)苹果酸(Malieaeid)乳酸钠(sodiumzaetie)柠檬酸钠(Citratesodium)延胡索酸(Fumaricaeid)酒石酸钠(Sodoumtartrate)硫代硫酸钠(Sodiumsuxrosulrate)十十十十十十十十十十十+十十(+)十+十十十十+十++十(+)十+十*生长符号表示:+:生长一:不生长表2Y6菌株对氨基酸的利用Table2UtilizationofaminoaeidbyY6strain氨基酸(Aminoaeid)Y6菌株代。strain)谷氨酸钠(sodium一glutamate)+++谷氨酞氨(G]utamine)-H-天冬氨酸(Aspartieaeid)一天冬酞氨(Asparaginate)(+)亮氨酸(Leueine)(+)丙氨酸(Alanine)+++甘氨酸(Glyeine)’‘+*生长符号表示:同表1第3期于温旭等:紫色非硫光合细菌的研究·347·2.4完整菌体和离体光合色素吸收光谱的测定菌体悬液吸收光谱和丙酮权取液的吸收光谱分别见图4和图5.从图可见,两者的吸收光谱曲线有一定的区别.离体的吸收光谱吸收峰向紫移动.这与光合色素在菌体中是与光合膜中的疏水蛋白和类脂相结合,而这种结合又极易被有机溶剂所破坏有关.2.SY‘菌株的生长情况从图6曲线中得知,在微好氧条件下菌的生长较厌氧条件下快,但最终厌氧生长时菌的光密度值要超过微好氧条件·经计算微好氧条件下菌的生长代时t*:一9·9h:厌氧条件下菌的生长代时IJ一。2一12·3h·2.6酵母膏对菌体生长的影响试验结果表明,酵一母膏对菌体生长有促进作用(见表3).据表3作图可得图7,由图知酵母膏浓度在0.1%以内对菌体的生长速率有较大的影响:菌体得率和酵母膏浓度在0.2%以内近似成正比.表3酵一母膏对Y6菌体生长的影响Tablc3EffcctofycastcxtractongrowthratcofY6strain酵母膏浓度c(g/L)最大生长速率(h)细胞得率(g/UConcentrationof以680nm处0.D.值求得GethreingratioyeastextraetMaximungrowthrateofeells0.10‘0110.670.20.0230.520.50.0620.701.00.0920.742.00.0941.072.7不同浓度乙酸钠和谷氨酸钠对Y‘菌生长的影响菌株Y6在不同浓度乙酸钠培养基中生长情况如图8.乙酸钠浓度在70mm。;内,对菌的生长影响不大.浓度为25mmol/L时最适生长.浓度高达200mmol/I能缓慢生长,只是延迟期大大加长.在不同浓度谷氨酸钠中的生长情况如图9.培养40h以内,Y6菌在谷氨酸钠浓度为5~20mmol/L的培养基中均能旺盛生长.浓度低于smmol/L时,前30h生长迅速,30h后氮源耗尽,‘生长停止,进人稳定期.2.SY‘菌株鉴定结果根据上述试验结果,参照Be吧ey手册第八版,以及vanNie一〔吕〕对RP.Paxustris的形态、生理的描述,R.Whittenbury和A.G.Melee(1967)对Rp.palustris出芽生殖的描述〔’〕,Tiupe:卜&Pfcnnig。975)对其碳源和电子供体利用的汇总资料c’〕,Goodwin对其类胡萝卜素的描述〔’o〕等表明,Y6菌株与Rp.palustrisha性状相同或接近,所以拟将Y6菌株定名为沼泽红假单胞菌(Rhodo那udomonas尸alust;15).任群、谷德智两同志协助部分测定工作;衷青同志协助进行扣胞的吸收光语测定:王秀珍同志协助绘图,特此致谢.·348·山东大学学报(自然科学版)第26卷图1Y6菌株液体培养形态Fig.1MorPha·ofY6straininliquideulture.图2Y6菌株鞭毛染色(Xl,000)Fig.2FigellumstainingofY6strain37I八Q.勺图3Y6菌株玖瑰花饰状排列Fig.3RosetteaggregationofY6strain图4Y6菌株菌体的吸收光谱Fig.4Theabso印tionspeetraofYSStrain·348·山东大学学报(自然科学版)第26卷图1Y6菌株液体培养形态Fig.1MorPha·ofY6straininliquideulture.图2Y6菌株鞭毛染色(Xl,000)Fig.2FigellumstainingofY6strain37I八Q.勺图3Y6菌株玖瑰花饰状排列Fig.3RosetteaggregationofY6strain图4Y6菌株菌体的48·山东大学学报(自然科学版)第26卷图1Y6菌株液体培养形态Fig.1MorPha·ofY6straininliquideulture.图2Y6菌株鞭毛染色(Xl,000)Fig.2FigellumstainingofY6strain37I八Q.勺图3Y6菌株玖瑰花饰状排列Fig.3RosetteaggregationofY6st