正交法研究光合细菌的混合培养

微生态制剂培养技术—正交法研究光合细菌的混合培养摘要利用光合细菌和蜡样芽孢杆菌协同生长的特点进行混菌培养试验。蜡样芽孢杆菌好氧，光合细菌兼性厌氧，通过两种细菌的不同添加比例，寻找一种最好的添加比例，使光合细菌活菌数在最短的时间内达到最大值。试验过程中，采用正交试验对两种菌的比例进行了科学的组合，从而找到两种菌的最佳配比：在光合细菌1%或5%、芽孢杆菌1%的添加量的情况下，可以在最短的时间内使光合细菌菌数达到理想值。关键词光合细菌；混菌培养；正交法近年来,随着生活水平的提高,人们对畜禽产品质量的要求越来越高,绿色食品越来越受到消费者的青睐。因光合细菌营养丰富,提高畜禽免疫力方面效果显著,而且在水产养殖方面,能净化水质,提供一部分活性氧,所以很多研究者对其尤为重视[1-3]。但因为光合细菌培养周期长,菌数很难达到人们要求,所以,研究者采用各种方法进行了光合细菌混菌培养试验的研究。GiraudEZ和FleischmanD(2004)研究发现,当光合细菌与根瘤菌共同培养时,可增强根瘤菌抗干扰能力,储藏的时间更长,在豆科植物上能形成更有效的根瘤,从而增加植物的产量[4]。李勤生等(1998)采用光合细菌不同菌株、光合细菌菌株与异养菌株混合培养,试验结果发现,不同组合的混合培养物其生长量均不同程度的高于单株培养物,最高增长量高达17.4%,最低也高于对照组[5]。本试验是在光合细菌单菌培养的基础上,进行了光合细菌和芽孢杆菌的混菌培养,目的就是提高光合细菌的生长速度,缩短培养周期,增加光合细菌的活菌数。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种光合细菌(9.0×108CFU/ml)和蜡样芽孢杆菌(1.0×109CFU/ml)均由本实验室分离、筛选、鉴定、保存。1.1.2培养基1.1.2.1光合细菌富集培养基乙酸钠3.0g、丙酸钠0.3g、NaCl1.0g、(NH4)2SO40.3g、MgSO40.2g、KH2PO40.5g、K2HSO40.3g、CaCl250mg、MnSO42.5mg、FeSO45mg、酵母膏0.lg、蛋白胨10mg、谷氨酸0.2mg、H2O1000ml,将以上组分溶于水后调pH值为7.4,然后在121.0℃蒸汽灭菌30min。1.1.2.2芽孢杆菌肉汤培养牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、H2O1000ml,pH值7.4～7.6,121.0℃下蒸汽灭菌30min。1.1.2.3芽孢杆菌平板普通培养基在肉汤培养基的基础之上,加入琼脂1.0%,121.0℃下蒸汽灭菌30min。1.1.2.4光合细菌计数培养基NaHCO31.0g、CH3COONa3.0g、酵母膏2.0g、K2HPO40.5g、Fe-EDTA0.005g、NH4Cl1.0g、MgCl2·6H2O0.2g、NaCl5.0g、H2O1000ml,pH值7.4～7.6、121.0℃下蒸汽灭菌30min。1.1.3仪器微量加样器、平板、1ml移液管、漩涡振荡器、试管等。1.2培养方式和条件1.2.1蜡样芽孢杆菌摇床培养用接种环刮取斜面保存的蜡样芽孢杆菌,平板划线,进行活化,37℃培养24h。使用灭菌的250ml三角瓶装芽孢杆菌肉汤培养基30～40ml,从平板上刮取菌落,接种到肉汤培养基上,37℃、130r/min摇床培养24h。1.2.2光合细菌富集培养[6]使用光合细菌富集培养基,在温度28℃,光照60W,光源距离培养物10～20cm,光照强度大约在600～1900LX之间。选择1000ml的三角瓶,装入1000ml光合细菌富集培养基,按不同比例接菌,使用封口膜封口,然后光照培养6～8d,观察颜色变化。颜色黑红色时保存,供混菌培养使用。试验研究《饲料工业》·2007年第28卷第4期311.2.3光合细菌和蜡样芽孢杆菌混合培养光合细菌富集培养基分装于消毒后的200ml三角瓶中,接种时采用光合细菌与蜡样芽孢杆菌同时接种,其中光合细菌1%、5%、10%、20%4个水平,而蜡样芽孢杆菌采用0.1%、0.5%、1%、2%4个水平,用正交组合法接种,然后按光合细菌富集培养条件进行光照培养。每隔24h采样一次,进行光合细菌计数培养,连续采样8d,每天计数培养一次。1.2.4细菌计数培养1.2.4.1菌液稀释采用常规方法对菌液稀释,即用移液管0.5ml菌液移于盛有4.5ml无菌水的试管中,漩涡振荡5次,每次10s,以此类推,将菌液稀释至10-6、10-7、10-8。1.2.4.2光合细菌计数培养用1ml移液管取不同稀释度(一般为10-6、10-7、10-8)和不同接种比例的混合培养后的菌液1ml,加到灭菌的平板上,然后加20ml灭菌的(45±1)℃光合细菌计数培养基,琼脂含量0.8%,摇匀;培养基冷凝后上层加5ml灭菌的(45±1)℃1.0%的琼脂,冷却后置25～30℃,2000～3000LX下培养48h,如果菌落不明显,则继续培养24～48h。1.2.4.3蜡样芽孢杆菌计数培养用微量加样器取不同稀释度(一般为10-1、10-2、10-3、10-4)的混合培养菌液20μl,同一稀释度在芽孢杆菌平板普通培养基上重复点样3次,37℃培养,12h后观察计数。1.3分析方法1.3.1光合细菌的计数方法[7-9]一般采用双层培养基,上层是1%的琼脂,底层是0.8%的琼脂。这种方法既解决了试管计数过程中出现的重复多次计数的问题,使计数在同一平面进行,计数更准确,而且上层1%的琼脂和底层0.8%的琼脂在不影响光合细菌生长的情况下,不但解决了光照问题,还解决了琼脂渗水的问题。1.3.2正交试验设计[10]表1为正交试验设计方案。正交法进行组合L16(24)。项目光合细菌蜡样芽孢杆菌110.1210.5311412550.1650.575185210100.59100.1111011210213200.114200.51520116202表1正交试验因素与水平设计（%）注:Maxn表示在第n天光合细菌菌数达到最大值;Means表示整个培养过程中,同一个处理选取的两个菌数最多时的平均值;第1d和第4d光合细菌菌数未有最大值。表2L16（24）正交试验结果处理组12345678910111213141516K1K2K3K4R光合细菌接种比例(%)111155551010101020202020400.58380.25186.25197.25214.33蜡样芽孢杆菌接种比例(%)0.100.50120.100.50120.100.50120.100.5012244.08251.5350.25318.5106.17Max2(107CFU/ml)41415752.54650Max3(107CFU/ml)42434337475758Max5(107CFU/ml)64.515077.554.547Max6(107CFU/ml)117907951Max7(107CFU/ml)82.572.51308597.582.5Max8(107CFU/ml)771147887Means(107CFU/ml)73.574.75122133.587.587.7584.2578.2541.5425052.7544.754751.5542结果(见表2)2.1光合细菌计数培养基中的形态观察光合细菌的典型特征是菌落呈粉红色、红色、红褐色或深红色,在计数培养基中菌落呈铁饼状。试验研究曹希亮等：微生态制剂培养技术———正交法研究光合细菌的混合培养322.2光合细菌正交试验从表2极差分析可以看出,光合细菌K1和K2的值都明显大于K3和K4的值,即光合细菌在1%和5%的两个水平上,细菌计数明显高于其它两组;而芽孢杆菌的K3和K4明显大于K1和K2,即芽孢杆菌1%和2%的接种量,效果比其它两组更好。而光合细菌和芽孢杆菌的极差分析表明,光合细菌的R=214.33,明显高于芽孢杆菌的R=106.17,从而得出如下结论,光合细菌的接种量对光合细菌的总菌数的影响高于芽孢杆菌的接种量对光合细菌总菌数的影响。2.3蜡样芽孢杆菌菌数变化5.004.003.002.001.000.00蜡1234567样芽孢杆菌数(106CFUml)时间(d)图1蜡样芽孢杆菌培养的动态方差分析研究图1通过SPSS13.0对蜡样芽孢杆菌的菌数变化进行了方差分析。我们发现,蜡样芽孢杆菌菌数第1d接种后,第2d达到最大值,第3d迅速下降,以后几天,蜡样芽孢杆菌的数量没有明显的变化,这可能是因为蜡样芽孢杆菌开始形成芽孢,进入了休眠状态。3讨论表2的结果说明光合细菌的添加比例1%和5%的时候,光合细菌菌数高于10%和20%的接种量。而10%和20%的接种量,最大值出现在第2d或第3d(Max2或Max3)。虽然10%和20%的接种量生长速度增快,但是,由于菌数太低,效果不好。综合考虑,从表2中发现,芽孢杆菌1%的生长效果好一些。添加了芽孢杆菌由于该培养基营养含量太低,芽孢杆菌很快就处于休眠状态如图1。所以对光合细菌的生长来说因为芽孢杆菌消耗一部分氧气,给光合细菌创造了一个有利于生存的厌氧环境,所以有利于光合细菌的生长。在该试验中,光合细菌的添加比例1%和5%的时候,光合细菌总数可以达到109CFU/ml左右,明显高于10%和20%两个水平。并且光合细菌的添加对光合细菌总数的增加的影响,明显高于芽孢杆菌的影响。从试验结果可以看出,不管是生长速度还是菌数,都没有达到一个理想的值,即菌数达到最大值的情况下,培养速度也提高了,降低培养时间的情形并没有出现。究其原因,可能是因为所使用的分离培养基里所含的酵母膏太少,又加入了芽孢杆菌,所以营养成分消耗殆尽。说明光合细菌虽然利用很少的营养成分,但是仍然需要一定的营养。再有一种可能就是,刚开始,芽孢杆菌没有充分给光合细菌创造一个完全的厌氧环境,所以,当光合细菌的加入量比较大时,很快就进入了衰退期,而光合细菌加入量较少的情况下,芽孢杆菌充分给光合细菌创造了厌氧环境,光合细菌的菌数达到了最大。但是,因为加入的营养成分太少,所以光合细菌生长的速度比较慢。为了达到一个最佳的效果,应该优化培养基,加入一定量的酵母膏等营养成分,为芽孢杆菌创造一个增殖的环境,同时为光合细菌创造一个更好的厌氧环境,使光合细菌生长速度更快。加入一定的营养成分对光合细菌生长很重要,大多数营养都被芽孢所利用,但剩余少量的营养成分可以促进光合细菌的生长,可以在更短的时间内达到更大的产量。所以,在光合细菌的光照、温度等条件达到最佳的情况下,培养基优化对混菌培养来说是最重要的。培养基的优化,因为是光合细菌和芽孢杆菌混菌培养,可以根据芽孢杆菌的营养成分设计不同的水平,进行正交试验设计,选择最佳培养基,这方面的内容有待于进一步研究。参考文献1刘如林，刁虎欣，梁凤来，等.光合细菌及其应用[M].北京：中国农业科技出版社，1991.155～2052李东风.光合细菌的开发应用动态[J].微生物学杂志，1998,18(2)：44～493PaulFWeaver,JudyD.Wall，HowardGest.CharacterizationofRhodopseudomonascapsulate[J].Arch.Microbiol.，1975,105:207～2164GiraudE,FleischmanD.Nitrogen-fixingsymbiosisbetweenphotosyntheticbacteriaandlegumes.PhotosynthRes.,2004,82:115～1305李勤生，卫翔.混合培养对光合细菌生长量的影响[J].水生生物学报，1998(6)：101~1056郭晨，刘春朝.光合细菌的培养及应用.中国饲料，1998(12)：187刘军义，汪文龙，李娟.正交法研究光合细菌计数培养基.检验检疫科学，2004,14(1):45～488孙军德，赵春燕，黄晓明，等.光合细菌菌数测定数学模型的构建[J].沈阳农业大学学报，2001,32(5):358～3599孙军德，赵春燕，李炳学，等.光合细菌双层平板计数方法的研究[J].沈阳农业大学学报，2001，32(2):110～11