经典液相色谱法2

二、薄层色谱参数包括定性参数、相平衡参数、分离参数、板效参数和定量参数等。1．比移值(Rf)在薄层色谱法中，一般采用定时展开(定时洗脱)，即观测在同一展开时间内组分与展开剂迁移的距离。组分的迁移距离(l)与展开剂的迁移距离(l0)之比称为比移值(Rf)。Rf=l/l0=u/u0(19·l)在展开后的薄层板上(图19－1)，l是由原点至某组分斑点中心(质量重心)的距离，l0是由原点至展开剂前沿的距离。(一)定性参数在定时展开的经典薄层色谱中，虽然展开剂的速度随展开距离的增长而下降，但仍可将Rf值看成是在一小段距离内组分迁移速度的平均值(u)与展开剂迁移速度的平均值(u0)之比Rf=u/u0=l/l0由于组分被保留在薄层固定相上，它的迁移速度总是小于展开剂的迁移速度，即u＜u0，组分的迁移距离也总是小于展开剂的迁移距离，即l＜l0，因此，Rf值总是小于1。不被固定相保留组分的Rf值等于1。实践中，Rf值的最佳范围是0.3～0.5，可用范围是0.2～0.8。比移值是薄层色谱的基本定性参数，它说明组分在色谱系统中的保留行为。在实验中需满足下述条件才能获得真实的Rf值：①展开室密闭不泄漏，薄层板周围空间被展开剂蒸气所饱和，无边缘效应②沿分离轨迹，固定相与流动相均无梯度变化③展开剂的前沿位置能正确测定比移值的数值除与组分的性质有关外，还与薄层板的性质(活性等)、展开剂的性质(极性、组成等)和温度有关。在薄层色谱使用的一般条件下，固定相、流动相都不很明确，它们都与蒸汽相一起维持着一种变化的状态，在分离过程中这三相都可能不断在变化。•在使用混合溶剂时，在展开过程中极性较弱、沸点较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，使Rf值相对变大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，这种现象称为边缘效应。•吸附剂的活化以及有意或无意的不同程度的去活化会改变其色谱行为•由于吸附剂层在被流动相润湿之前吸附蒸汽，空隙率发生了变化，随之流动相的表观速度也变化了。流动相并不是均匀地穿过吸附剂层的。•特别在使用混合流动相时，在色谱过程中当溶剂前缘通过吸附剂层时会造成流动相中的溶剂梯度。即使使用单个溶剂的系统，也会在溶剂前缘的方向表现出杂质的梯度。•在展开过程中还应注意空气中的湿度•温度的变化也影响溶剂的挥发性而影响Rf值和分离效果。2．相对比移值(Rr)由于影响Rf值的因素很多，要在不同实验室、不同实验者间严格控制色谱条件的一致性，达到Rf的可比性很困难。因此建议采用相对比移值(relativeRf；Rr)作为定性参数：Rr=Rf(a)／Rf(s)=la／ls(19·2)式中Rf(a)和Rf(s)分别为组分a和参考物质s在同一薄层板上、同一展开条件下所测得的Rf值，la和ls分别为原点至组分a和参考物质s的斑点中心的距离。由于参考物质与组分在完全相同的条件下展开，能消除系统误差，因此Rr值的重复性和可靠性都比Rf值好。参考物质可以是加入样品中的纯物质，也可以是样品中的某一已知组分。由于相对比移值表示的是组分与参考物质的移行距离之比，显然其值的大小不仅与组分及色谱条件有关，而且还与所选参考物质有关。与Rf值不同，Rr值可以小于1，也可以大于1。(二)相平衡参数1．分配系数与比移值的关系第十八章讲过，如果组分分子在展开剂中出现的几率是R’，则它在薄层板上的移动速度是展开剂移动速度的R’倍，即u=R’u0，或R’=u/u0；由比移值的定义可知Rf=l/l0=u/u0，所以Rf=R’，即比移值与组分分子在展开剂中出现的几率在数值上相等。已经知道1／R’=1+KVs／Vm，所以(19·3)式中Vs和Vm分别为薄层板上固定相和展开剂的体积，K为分配系数，是相平衡参数之一(见第18章)。smmmsfKVVVVKVR/11msmmssVVKVCVCRR''1要实现两组分的分离，就必须使它们的K不等。与K有关的因素：•组分的性质•薄层板的性质•展开剂的性质•温度当实验条件固定时，K只与组分性质有关，即Rf值只与组分性质有关。因此Rf值是薄层色谱的定性参数。2．容量因子（capacityfactor）容量因子又称为质量分配系数，即达到分配平衡后，组分在固定相和展开剂中的质量之比，是重要的相平衡参数。k=Ws／Wm=CsVs／CmVm=KVs／Vm=K／b(19·4)由式(19·3)和式(19·4)可得Rf与容量因子k之间的关系：Rf=l／(l＋k)(19·5)或k=(1Rf)／Rf(19·6)3．影响比移值的因素由上面的讨论可知，凡影响组分分配系数的因素均影响Rf值。主要有以下几个方面：①被分离物质的结构和性质。不同组分与薄层及展开剂的作用力不等，在两相间的分配系数不等，结果有不同的Rf值。在硅胶薄层板上的吸附色谱中，一般说来极性较强的组分Rf值较小②薄层板的性质。固定相的粒度，薄层的厚度等都影响组分的Rf值。吸附薄层色谱中吸附剂的活性越强，其吸附作用就越强，使组分的Rf值越小③展开剂的性质。展开剂的极性和组成对组分的溶解能力及其与固定相作用的强弱等都影响组分的Rf值。在吸附薄层色谱中，极性越强的展开剂与吸附剂的作用越强，使组分与吸附剂的作用相对减弱，Rf值增大。④温度对吸附色谱Rf值的影响较小，但对分配色谱的影响很大，这是因为溶解度受温度影响大。⑤展开室内的展开剂蒸气饱和程度对Rf值有较大影响。如果薄层板周围未被展开剂蒸气饱和，在展开过程中展开剂不断蒸发，使展开剂组成发生变化，改变组分的Rf值。由此可见，为了获得适当的Rf值，需要选择适当的固定相和展开剂等色谱条件。同时应保持恒定的色谱条件，以保证Rf值的重现性。(三)分离参数1.分离度（resolution；R）分离度是薄层色谱法的重要分离参数。两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度（直径）的比值称为分离度或分辨率。R=2d／(W1+W2)(19·7)上式中d为两斑点中心间的距离，W1、W2分别为两斑点的宽度；在薄层扫描图上，d为两色谱峰顶间距离，W1、W2分别为两色谱峰宽(图19－2)。分离度也可以用比移值来计算：(19·8)210122WWRRlRff图19－2薄层色谱分离度示意图2.分离数（separationnumber；SN）是衡量薄层色谱分离容量的主要参数。也是板效的评价参数。分离数是在Rf=0和Rf=1之间可能分离的组分的最大数目。实际含义是：在相邻斑点的分离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1。其定义式为：SN=l0／(b0+b1)1(19·9)式中b0和b1分别为由薄层扫描所得的Rf=0和Rf=1的组分的半峰宽(峰高一半处的峰宽)。实际上，b0和b1均不能直接由薄层扫描图上测得。而是通过测量其他组分的Rf值和半峰宽，二者在一定点样量范围内成直线关系，由回归方程用外推法求得b0和b1。经典薄层板的分离数为7～10，高效薄层板在10～20范围内。三、吸附薄层色谱法薄层色谱用硅胶：粒度为10～40mm，比表面积约为500m2／g，比孔体积约为0.4ml／g，平均孔径约为100nm，常用硅胶的硅醇基密度为8mmol／m2。常用于薄层色谱的硅胶•硅胶H：不含粘合剂，铺成硬板时需另加粘合剂•硅胶G：是硅胶和锻石膏(Gypsum)混合而成•硅胶HF254：不含粘合剂而含有一种无机荧光剂如锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4：Mn)，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景•硅胶GF254及硅胶HF254+366等含荧光剂的吸附剂制成的荧光薄层板可用于本身不发光且不易显色的物质的研究。用于薄层色谱的氧化铝•氧化铝G•氧化铝H•氧化铝HF254氧化铝活度的薄层色谱法测定：取(I)偶氮苯、(II)对甲氧基偶氮苯、(III)苏丹黄、(IV)苏丹红、(V)对氨基偶氮苯、(VI)对羟基偶氮苯(按极性大小排列)。分别以石油醚(沸点60～90℃)苯(4:1)为溶剂，配成0.04％溶液。把染料溶液点在待测活性的氧化铝薄层板(软板)上，每种点2～4mg，用石油醚(沸点60～90C)为展开剂，展距为10cm，斑点中心在10.5cm处的染料的号数即为氧化铝的活度级数。如有两个染料都在这一范围内，则属其间的等级。此法仅用5～10分钟就可完成测定。而且同样适用于硅胶的活度测定。吸附剂粒径对展开速度、Rf值和分离效果的影响：•颗粒大，则总表面积小，吸附量低，展开速度快，展开后斑点较宽，分离效果差。•颗粒太小，则展开速度太慢，而且不易用干法铺板。因此，应该选用颗粒大小适宜的吸附剂，而且其粒度分布要窄。吸附剂颗粒大小表示方法：•颗粒直径(以mm表示)，•筛子单位面积的孔数(以目表示)干法铺板所用吸附剂颗粒直径一般在75～100mm或150～200目较为合适，而湿法铺板则用更细的颗粒，为10～40mm或250～300目。聚酰胺则一般在100～180目范围内。高效薄层板的颗粒直径为5～10mm。薄层板质量要求：•吸附剂涂铺均匀•表面光滑•厚度一致现在已有许多商品预制板可供选择，但由于价格等原因，还经常需要自己制备薄层板。1.载板的准备载板必须是表面光滑、平整清洁。使用前先用适当方法进行必要的处理。若玻璃板上存有油污，则薄层不易铺成，且很容易发生薄层翘裂脱落现象。(二)薄层板的制备2.软板的制备：直接铺制吸附剂。3.粘合薄层板(硬板)的铺制(1)粘合剂：粘合剂的种类与用量会影响分离的效果，常用的有煅石膏、羧甲基纤维素钠(CMCNa)和某些聚合物如聚丙烯酸等。参看《分析化学实验》。(2)倾注法制板：1.在玻板上倾倒吸附剂糊，2.用洁净玻棒涂铺均匀，3.稍加振动。(3)平铺法制板：在水平台面上先放置玻璃平板，上面放置载板，二边加上玻璃条做成的框边(框边高于载板0.25～lmm)，将吸附剂糊倒在载板上，刮平并振动均匀。上述两法所铺薄层板只适宜于一般定性分离，不宜于定量分离。(4)机械涂铺法制板(制备定量薄层板)：自动铺板器工作时，在电机驱动下装吸附剂糊的给料槽与载板相对运动，将吸附剂糊均匀地涂铺于载板上。用涂铺器可以一次铺成多块板，且所得板的质量高、分离效果好、重现性好，可作定量分析薄层板。4.活化铺好的硅胶板晾干后，在105～110C进行活化0.5～l小时，冷却即可使用，也可保存于干燥器中备用；有些薄层板铺好后阴干即可使用，有的薄层板如聚酰胺薄层板需要保存在一定湿度下，才能获得较好的分离效果，。为消除污染物的影响，可先将薄层板用较强极性的溶剂先展开一遍。如硅胶板可用甲醇或含有1％～5％氨水的甲醇预先展开，110C干燥1小时。1.展开剂选择的一般原则吸附薄层色谱条件的选择主要是展开剂的选择(争夺吸附剂表面活性中心的能力)。而选择时必须同时考虑待分离组分的性质(主要是极性)和吸附剂的活性。•分离极性较强的组分时，宜选用活性低(级别高)的薄层板，以强极性洗脱剂展开(否则组分Rf值太小,推不动)•分离弱极性的组分时，宜选用活性高(级别低)的薄层板，以弱极性展开剂展开，否则Rf值太大•中等极性组分采用中间条件进行分离总之，通过选择薄层板和展开剂，调整待测组分的Rf值在0.3～0.5范围内为宜。(三)吸附薄层色谱的展开剂若将三角形中表示被分离物质极性的A角指向某一部位，则B、C就能粗略地指出所需的色谱系统。例如，若将A角指向极性物质，则B角就指向活性弱的吸附剂，而C角就指向极性展开剂。图19－3化合物的极性、吸附剂活度和展开剂极性间的关系根据被分离组分的性质、展开剂的极性和吸附剂的活度三个因素。Stahl设计了一个选择吸附薄层色谱条件的简图(图19－3)。从该图可见，圆周的三部分分别代表上述三因素。2.二元和多元展开剂用单一溶剂为展开剂时，分离重现性好。但对于难分离的组分往往需要采用二元、三元甚至多元溶剂作为展开剂。其中主要溶剂起溶解样品和基本分离的作用，次要溶剂起调整Rf值、改善分离度和对某些组分的选择性作用。一般主要溶剂选用不易形成氢键或极性比待分离物质弱的溶剂。•极性较强的溶剂使组分在薄层上迁移•极性较弱的溶剂降低展开剂的洗脱能力•中等极性溶剂：中介混溶剂•有时需要加入