鄱阳湖水体细菌群落组成及遗传多样性1

第22卷筇10期环境科学研究VO1．22．No．102009年1O，]ResearchofEnvironmentalSciencesOct．．2009鄱阳湖水体细菌群落组成及遗传多样性吴兰，葛刚，龚世杰，朱国锋，万金宝1南吕大学分子物晕点实验审，江西南昌3300312．南H大学环境J化学工秤学院，江西南昌330031摘要：利用建细蒲16SrRNA罄因文库和限制性内切酶长度多态性(RFLP)分析的方法，对鄱阳湖南、北湖区水体的细菌多样性进行了研究．结果表明．鄱刚湖水体细菌多样性较高，且南湖区2007年水体的细菌多样性明显高于其2006年水体和北湖区水体．主要细蒲成分析表日』j，鄱阳湖水体中的349个阳性克隆代表的167种基因型分别属于十大细菌类群，变形菌门(ProtbactPrin)在4个克降文庠中占据了47％～81％，数量极其丰富，尤其足亚型的一变形菌为优势菌群；拟杆菌门(Baeteroidet)和放线¨(Actinobacterin)也广泛分布，且有2．9％17．1％的克隆数属于未分类细菌．研究结果进一步提示鄱阳湖水体有一定程度的富营养化．关键词：鄱阳湖；限制性内切酶长度多态性；16SrRNA摹因文痒；细菌多样性中图分类号：X524文献标志码：A文章编号：1001—6929(2009)10—1145—05GeneticDiversityandCompositionofBacterialCommunityinWaterofPoyangLakeWULan～，GEGang一，GONGShi—jie，ZHUGuo—feng，WANJin—bao1．KeyLaboratoryofMolecularBiology，NanchangUniversity，Nanchang330031，China2．EnvironmentalandChemicalEngineeringCollege，NanchangUniversity，Nanchang330031，ChinaAbstract：Abacterial16SrRNAgeneclonelibra~andrestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP)analysiswereusedtoinvestigatebacterialphylogeneticdiversityintheNorthandSouthregionsofPoyangLakeTheresultsshowedthattherewasgreatbacterialdiversityinthewaterofPoyanglake，andthebacterialdiversityintheSouthregionofthelakein2007wassignifcantlyhigherthanthatinNorthregionandthatintheSouthregionin2006．Phylogeneticanalysisrevealedthat167genetictypesfrom349clonesobservedinthewaterofPoyangLakebelongedtotenhacterialphyla．47％一81％ofbacteriafromfourclonelibrarieswereaffiliatedtoProteobacteria．especially一proteobaz'teria．BacteroidetesandActinobacteritwerecommonlyfoundinfreshwater．Unclassifedbacteriaaccountedfor2．9％一17．1％．furtherindicatingsomeextentofeutrophicationinPoyangaLke．Keywords：PoyangImke：RFIP：16SrRNAgenelibra,'：bacterialphylogeneticdiversity0生物是地球生物圈的重要组成部分，它们既0营养物的转化和分解者，又是能量和物质的储存0，也是食物链中重要的生产者_，尤其是异养细菌，它们可分解水体中的大分子有机物，将其转化成细菌自身生物量或矿化成营养盐以供浮游植物的进步使用．因此，人们普遍认为，细菌在水生态系统收稿日期：2009—02—07修订日期：2009一o4—24基金项目：国家科技支撑计划项目(2007BAC23BO1)；国家自然科学基金项目(30860062)；江西省自然科学基金项目(2007GZN1927)；教育郝长江水资源国家重点实验寰基金项Fj(YRWEPO7005)作者简介：吴兰(1969～)，女，江西萍乡人，w1690902@hotmailc0m*责任作者，万金保(1952一)，男，江西南昌人，教授，博士，主要研究水处理技术[e-mail]的能量与物质流动中以及在营养循环中扮演着重要的角色。～．对湖泊细菌的结构、功能以及多样性的认识，有利于了解整个湖泊生态系统的特点，并可以评价水体的受污染程度．鄱阳湖是中国第一大淡水湖，为过水性吞吐型湖泊．它以松门山为界，分为南、北两大主湖区，北湖区连接长江为一过水性通道，南湖区水体相对稳定。．该湖泊蕴藏着丰富的生物资源，但因其水体正向富营养化过渡而日益受到人们的重视．如王毛兰等∞对鄱阳湖的水体氮、磷污染进行了调查；葛刚等。对鄱阳湖区南矶山自然保护区内的种子植物区系进行了调查．然而，南于微生物研究方法学的限制以及微生物本身的低培养性j，使得目前对鄱阳湖微生物的遗传多样性的了解还不够深入．笔者通环境科学研究第22卷过采用分子生物学方法，构建细菌16SrRNA基因文0，并对其16SrRNA基因进行了限制性内切长度多0性(RFLP)分析，以阐述鄱阳湖水体细菌遗传多样性．1材料与方法1．1样品的采集鄱阳湖水体样品分别于2006年10月采自鄱阳湖北湖区采样点1(29。2050．95N，116。0414．66”E)(样品记为PYSI)和南湖区采样点2(29。0910．06”N，116。0424．57”E)(样品记为NHI)，2007年5月采自北湖区采样点3(29。2020．63”N，i16。0343．29”E)(样品记为PYSⅡ)和南湖区采样点4(29。1038．29”N，I16。1015．27”E)(样品记为NHⅡ)．由于采样点1，2和4湖水的平均水深不足513，因此其水体样品分别在水面下0．513和水底上0．5m处采集并混合；由于采样点3湖水的水深超过5In，因此其水体样品分别在水面下0．5和3rn以及水底上0．51处采集并混合．将1L湖水经0．22m滤膜(Milipore，USA)过滤，过滤物和滤膜共同保存在一80℃下备用．1．2湖泊微生物基因组总DNA的制备细菌总DNA的提取采用文献[9]的方法并略作改动．具体步骤：将滤膜上的微生物细胞用裂解缓冲液[50mmol／LTris—HC1(pH为8．0)，20mmol／LEDTA，50mmol／L蔗糖]冲洗，将收集的菌液在4℃12000r／rain下离心10min，而后将离心下来的细胞0行溶菌酶／蛋白酶K／SDS处理，并通过液氮65c反复的冷热处理使细胞壁破碎并离心．采用等体积的溶液[V(Tris一饱和酚)：V(氯仿)：V(异0醇)为25：24：1]抽提并取上清液，再加入氯仿和异0醇溶液[(氯仿)：V(异戊醇)为24：1]抽提2次，上清液加入0．25倍体积的3mol／L(pH为5．2)乙酸钠混合，2倍体积的无水乙醇于一20℃下过夜沉淀，离心弃上清液后细菌基因组DNA用TE回溶．1．3细菌16SrRNA基因的PCR扩增细菌16SrRNA基因的PCR扩增采用通用细菌引物1492R(5GGTTACCrITrGTrACGACTT3)和细菌特异引物27F(5AGAGTYTGATCCTGGCTCAG3，)(引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司)进行n．50L的PCR反应体系中包括：5UTaq酶(TaKaRaBiotechnology)，2种引物各0．2Fmol／L，5的模板DNA，1～mmol／LMgCI：，200mol／LdNTPs，5L10×PCRbufer用无菌水调整到50L体积．扩增条件：94℃预变性4min，94oC变性1min，45℃退火90s，72℃延伸2min，26个循环，最后在72℃延伸10min．PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)纯化．1．4克隆文库的建立和RFLP分析将纯化后的细菌16SrRNA基因片段连接到pMD18一T载体(TaKaRaBioteehnology)并转化进入大肠杆菌DH5a感受态细胞内，4个样品分别建立文库．各文库随机挑选96个克隆进行PCR扩增筛选．将得到的阳性克隆抽提质粒各加入1U的HaeⅢ和Hinf1限制性内切酶，37c酶切过夜．酶切结果用3％的琼脂糖电泳检测进行RFLP结果分析n．1．5序列测定及系统发育将具有相同RFLP类型的克隆进行测序后，在线(htp：／／rdp8．eme．mSH．edu／cgis／chimera．c?su：SSU)分析除去嵌合体；同时进行文库内序列比对，各文库中序列的遗传相似性97％被归为同一类操作单元类型(OTUs)．将得到的序列在GeneBank数据库中查找最相似序列，并进行细菌的系统发育分析㈨．1．6统计分析采用文库覆盖率(c)来评价库容是否涵盖了该采样点的环境微生物．计算公式：0=(1一nl，N)x100％0中，Ⅳ为克隆文库内的阳性克隆数，个；n为文库0只出现过一次的OTUs数量，个．2结果与分析2．1微生物总DNA的提取和细菌16SrRNA基因片段的扩增环境微生物基因组DNA的质量是决定后续试验能否进行的关键．由于湖泊水体中杂质含量多，微生物含量少，因此难以得到高纯度和高质量的微生物DNA．采用改进的DNA提取法提取湖泊水体细菌DNA，1％琼脂糖电泳图谱见图1．由图1可见，该方法提取的微生物基因组DNA长度约为20kbp，较好地保证了微生物基因组的完整性．模板的质量和浓度对PCR扩增的影响十分重大，如果模板中含有杂质蛋白(特别是染色体中的组0白)，以及含有酚等其他杂质，或有Taq酶抑止剂0，都会对PCR扩增产生严重影响．因此，在PCR体系中采用不同的模板稀释梯度对细菌16SrRNA基因进行PCR扩增，结果见图2．第l0期吴兰等：鄱阳湖水体细菌群落组成及遗传多样忾I限制性内切酶的酶切，部分酶切结果图3000bp500bp300bp一～～M—Marker：1一PYSi：2-NHl(a)Ha~I1酶切Pt三M图1鄱阳湖水样细菌基因组DNA电泳图1000bpFig．1Theelectrophoretogramof500bpthebacteriagenomieDNA300bpinPoyangLakefb)HinfI群切图316SrRNA基因的部分酶切结果Fig．3Partialresultsofbacterial16SrRNAgenesfragmentsbydigestedenzyme在4个文库中随机挑选的384个克隆中，鉴定由图2可n，鄱尢湖水样微事物基因组DNA模板经过10和100倍的稀释后，都能扩增出大小为1500bp的细菌16SrRNA基因片段，但稀释lO倍时所获得的细菌16SrRNA基因PCR扩增结果明显好于稀释100倍时，而直接来自湖水微生物DNA模板和模板稀释1000倍后都没能扩增出目的片段．因此随后进行的4个采样点样品的细菌16SrRNA基因PCR均在模板稀释l0倍的条件下扩增．2．2RFLP分析分别对4个样品扩增得到的细菌16SrRNA基因建文库，阳性克隆筛选后分别进行Hae1I和Hinf共得到349个阳性克隆．分别利用HaeⅢ和HinfI酶切后经RFLP图涪分析，获得222个不同的RFLP类型．其中，最多的RFLP类型是来自采样点4的文库，其85个阳性克隆中含有65种RFLP类型；最少的是来自采样点3的文库，其88个5H性克隆中含有44种RF