IP实验原理

IP实验原理免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proteinA/G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarosebeads孵育；抗体-agarosebeads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。IP实验步骤基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30min后取上清；(2)取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50μlproteinA/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C以3,000g速度离心5min，将proteinA/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，proteinA/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE,Westernblotting或进行质谱分析。一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarosebeads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl，一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a．缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b．NaCl浓度一般习惯用150mM，这主要是因为150mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl的浓度可以低到50mM，150mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c．甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d．裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过ProteaseCocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。e．去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：-细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。-膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。-蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。二、抗体-agarosebeads孵育裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80°保存3个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarosebeads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入ProteinA或者Gbeads孵育过夜，也可以同时加入抗体和ProteinA或者Gbeads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白（1mg/ml）对应添加1ug抗体，最高可以添加至5ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG，但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时，为避免ProteinA或者Gbeads有（非）特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将ProteinA或者Gbeads与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarosebeads孵育。同时，ProteinA或者Gbeads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig亚型，选择合适的ProteinA或者Gbeads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用ProteinA和ProteinGbeads的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。三、抗体-agarosebeads复合物洗涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarosebeads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的SDS洗涤抗体-agarosebeads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛（见IP：Q&A），而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段（比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加ProteinA/Gbeads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarosebeads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白，ProteinA/Gbeads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及ProteinA/Gbeads三者之间是以非共价健结合在一起，只有ProteinA/G与agarosebeads是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去ProteinA/Gbeads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子（55KD）和轻链分子（25KD）。因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大（1ug），所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。针对上述情况，通常有二种解决办法：a．选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。b．使用交联剂将抗体和ProteinA/Gbeads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarosebeads复合物，最后离心去除抗体-agarosebeads复合物，上清中只留下目的蛋白。免疫沉淀实验方法免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如“proteinA”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的分离抗原的免疫学方法。目前多用的“proteinA”等预先结合固化在Agarosebeads上，使之与含有抗原的溶液几抗体反应后，beads上的proteinA就能吸附抗原达到精制的目的。实验材料试剂及缓冲液：①细胞裂解产物（样品）；②ProteinGorProteinAslurry；③一抗；④细胞裂解缓冲液；⑤PBS；⑥SDS-PAGEsamplebuffer；⑦蛋白酶抑制剂样品（细胞裂解物）准备：1.收集约107细胞。（注：1ml体积中所含细胞总数和合适的凝胶上样量取决于不同蛋白以及其抗体的特性）2.加入约10ml的PBS到锥形管中，并用400×g离心10分钟洗涤细胞。3.弃去上清液并重复第2步洗涤细胞。（注：对于细胞培养皿中的单层贴壁细胞，吸除细胞培养液后，用PBS洗涤两次，尽量避免破坏细胞层）4.完全弃去上清液后，加入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂（ProteaseinhibitorCocktail）的细胞裂解液重悬细胞。小心地vortex混匀.（注：为防止蛋白酶的作用，细胞裂解液应当预冷。所有接下来的操作都在低温条件下进行，并且蛋白酶抑制剂预先添加到细胞裂解液中;此步骤对于细胞培养皿中的单层贴壁细胞，可在10cm的培养皿中加入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解）。5.把锥形管或培养皿放在冰上孵育30分钟，并间断性地混匀。6.4℃，10000×g离心细胞裂解物15分钟。7.小心地收集上清液转置干净的管中备用；此样品可冻存于-80℃作长期保存。样品的预清洗(可选做)：8.在eppendorf管中加入50ulProteinGbeadslurry，并加入450ul预冷的细胞裂解液。10000×g离心30秒后弃去细胞裂解液;用500ul预冷的细胞裂解液重复洗涤一次，最后用50ul预冷的细胞裂解液重悬微球。9.把洗涤好的50ulProteinGbead加入到盛有500ul细胞裂解样品的eppendorf管中，于冰上孵育30-60分钟。10.4℃，10000×g离心10分钟后把上清液转移到新的eppendorf管。若转移过来的上清液中仍含有ProteinGbead，可以再次离心处理后小心地转移上清到另一新的eppendorf管。免疫沉淀：11.在盛有预清洗的细胞裂解样品的eppendorf管中加入5-10ug相应抗体。（注：抗体的浓度是影响免疫沉淀反应的重要因素；建议实验者进行预实验摸索出合适的使用浓度）12.4℃孵育1小时。13.加入50ul预洗的ProteinGbeadslurry（微珠处理参考上面样品的预清洗中第一步方法）。14.于4℃旋转混匀孵育1小时。15.4℃，10000×g离心eppendorf管30秒。16.小心并尽量完全地移除上清液后用500ul的细胞裂解液洗涤微珠3-5次；为减少非特异背景影响，每次洗涤都要尽量小心并完全地移除上清液。17.最后一次洗涤并弃去上清液后加入50ul的Laemmlisamplebuffer工作液。旋涡混