液相色谱—质谱联用的原理及应用

LOGO液相色谱—质谱联用的原理及应用QuattroLC/MicroLOGOContents色谱法与质谱法1质谱仪的联用及原理2质谱图的分析及应用3注意事项4LOGO一、色谱法引论色谱法（chromatography）是一种利用物质的物理化学性质建立起来的分离、分析方法。广泛用于复杂化合物的分离分析。实质：分离目的：定性或定量分析LOGO色谱法的由来1906年由俄国植物学家Tswett创立首先用于植物色素分离LOGO固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚色带LOGO50年代后期出现了气相色谱-质谱联用技术。1955年Golay建立了毛细管气相色谱法。60年代末发展了高效液相色谱法。70年代发展了薄层扫描技术。80年代超临界流体色谱和毛细管电泳LOGO色谱法分类按两相分子的聚集状态分为：流动相固定相类型气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱GC液相色谱LC液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱LOGO二、质谱法质谱分析法是将不同质量的离子按质荷比（m/z）的大小顺序收集和记录下来，得到质谱图，用质谱图进行定性、定量分析及结构分析的方法质谱分析法是物理分析法，早期主要用于相对原子质量的测定和某些复杂化合物的鉴定和结构分析随着GC和HPLC等仪器和质谱仪联机成功以及计算机的飞速发展，使得质谱法成为分析、鉴定复杂混合物的最有效工具LOGO1、突出特点（与核磁、红外、紫外相比）1）质谱法是唯一可以确定分子质量的方法2）灵敏度高，样品用量少通常只需微克级样品，检出限可达10-14g3）应用范围广质谱仪种类很多，应用范围广，可进行同位素分析，也可进行化学分析，可进行无机成分、有机结构分析被分析对象：气体、液体、固体LOGO局限性：(1)异构体，立体化学方面区分能力差。(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专人操作。(3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。LOGO2、质谱仪的联用技术质谱仪可以与其他仪器联用，如气相色谱-质谱联用（GC/MS）、高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）；也可以质谱-质谱联用（MS-MS）。LOGO（1）GC/MS、HPLC/MS仪：基于色谱和质谱的仪器灵敏度相当，加之使分离效果好的色谱成为质谱的进样器，而速度快、分离好、应用广的质谱仪作为色谱的鉴定器，使它们成为目前最好的用于分析微量的有机混合物的仪器。LOGO液相色谱-质谱联用LOGOＬＣ－ＭＳ联用仪器的组成包括ＬＣ、接口和ＭＳ三部分，HPLCCAP-LCUPLCAPI（ESI,APCI,APPI….)MagnetsectorQuadrupole,TSQLontrapTofFT-icr液相色谱仪接口及离子化技术质谱仪LOGOLOGO（2）液质联用与气质联用的区别:气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。LOGO具体应用领域医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机化学：表面活性剂、染料LOGO（3）MS-MS：质谱-质谱法是70年代后期迅猛发展起来的。这种方法是指用质谱作质量分离的质谱技术(massseparetion-massspectracharacterization)。它可以研究母离子和子离子的关系，让大的离子进一步裂解，获得裂解过程及离子组成的信息。它有几种称呼，如质谱-质谱法（MS-MS或MS/MS）,串联质谱,二维质谱法,序贯质谱。本实验室的质谱检测器为三重四极杆检测器，属于MS/MS型质谱检测器LOGO三、质谱分析法原理和仪器1、质谱分析法基本原理质谱法一般采用高速电子来撞击气态分子，将电离后的正离子加速导入质量分析器，然后按质荷比（m/z）的大小顺序进行收集和记录，得到质谱图，根据质谱峰的位置进行定性和结构分析，根据峰的强度进行定量分析气态分子高速电子撞击正离子加速导入质量分析器按m/z的大小收集质谱图峰位置定性定结构峰强度定量分析LOGO质量分析器离子源分子分离器LOGOLOGO2、基本术语（1）质谱图：一般都采用“条图”，或称为棒状图。在图中横轴表示质荷比（m/z，因为Z接近于1，故实际上m/z多为离子的质量）。纵轴则表示峰的相对强度(RA,相对丰度)。(2)质荷比:离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z。(3)峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。LOGO(4)离子丰度:检测器检测到的离子信号强度。峰越高表示形成的离子越多，也就是说，谱线的强度是与离子的多少成正比的。(5)基准峰：在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰，其离子峰的峰高作为100%,而以对它的百分比来表示其他离子峰的强度。(6)总离子流图:在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图.LOGO(7)质量色谱图:指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图。利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。LOGO1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100质量色谱图总离子流图LOGO四、质谱图和主要离子峰1、质谱的表示方法在质谱分析中，质谱的表示方法有条图和表格形式。m/z值273951相对强度———LOGO图14-5是一张条图，又称质谱图。以质荷比m/z为横坐标，离子相对强度为纵坐标，相对强度是把原始质谱图上最强的离子峰定为基峰，规定其相对强度为100%，其它离子峰以对基峰的相对百分值表示，由质谱图很直观地观察整个分子的质谱信息。LOGO质谱表是用表格形式表示质谱数据，由质谱表可准确地给出m/z值及相对强度。正丙烷的质谱m/z值273951相对强度———LOGO2、质谱中主要离子峰从质谱图上可看到许多离子峰，这些峰的m/z和相对强度取决于分子结构，还与仪器类型，实验条件有关。质谱中出现离子峰，归纳起来有以下几种：分子离子峰，碎片离子峰，同位素离子峰，重排离子峰及亚稳离子峰等。LOGO（一）分子离子峰分子受电子束轰击后失去一个电子而形成的离子称分子离子峰分子分子离子由所形成的峰称为分子离子峰。因此，分子离子峰的m/z的数值就是该化合物的相对分子质量Mr。是有机化合物的重要质谱数据eMeM2MMLOGO分子离子峰若能出现，应位于质谱图的右端。几乎所有的有机分子都可以产生可以辨认的分子离子峰。有些分子如芳香环分子可产生较大的分子离子峰，而高分子量的脂肪醇、醚及胺等则产生较小的分子离子峰。若不考虑同位素的影响，分子离子应该具有最高质量。其相对强弱随化合物结构而变化，其强弱顺序一般为芳环共轭多烯烯环状化合物羰基化合物醚酯胺酸醇高度分支的烃类。分子离子峰的强弱也与实验条件有关。LOGO（二）碎片离子峰当轰击电子的能量超过分子离子电离所需的能量时（约为50~70eV），使分子离子的化学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子，在质谱图上相应的峰，称为碎片离子峰。碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。LOGO（二）碎片离子峰一般有机化合物的电离能为7－13电子伏特，质谱中常用的电离电压为70电子伏特，使结构裂解，产生各种“碎片”离子。H3CCH2CH2CH2CH2CH315712957434357297115H3CCH2CH2CH2CH2CH3H3CCH2CH2CH2CH2CH3H3CCH2CH2CH2CH2CH3H3CCH2CH2CH2CH2CH3CH3CH2CH2CH2CH2CH31529435771正己烷LOGO例丙酮m/z=58m/z=15m/z=43分子离子碎片离子进一步断裂产生新的碎片离子分子的断裂即产生什么样的碎片离子与分子结构有密切的关系。通常根据主要碎片离子峰及相对强度为推测分子结构提供参考信息。CH3CO3CHCH3CO3-CH-15-18-COCH3+++LOGO（三）同位素离子峰除P、F、I外，组成有机化合物的常见的十几种元素中C、H、O、N、S、Cl、Br等都有同位素，因而在质谱图中会出现不同质量的同位素形成的峰，称为同位素离子峰。例天然碳中，存在12C和13C两种同位素，如果12C组成的分子质量为M，由13C组成的分子质量为M+1，M+1峰为M峰的同位素峰。LOGOP270表14-1列出了有机化合物中常见元素的天然同位素丰度和峰类型。同位素峰的强度与同位素的丰度是相对应的。从表中看到S,Cl,Br等元素同位素丰度高，因此含S,Cl,Br的化合物其M+2峰强度较大。一般根据M和M+2两个峰的强度来判断化合物中是否含有这些元素。LOGOLOGO（四）重排离子峰分子离子在裂解成碎片时，某些原子或基团重新排列或转移而形成的离子，称为重排离子，质谱图上相应的峰为重排离子峰。重排的类型很多，其中最重要的是麦氏重排。可发生麦氏重排的化合物有：酮，醛，酸，酯等。·含有C=O，C=N，C=S及碳碳双键·与双键相连的链上有碳，并在碳上有H原子（氢）·H转移到杂原子上，同时键发生断裂，生成一个中性分子和一个自由基阳离子麦氏重排条件：LOGO（五）亚稳离子峰离子在离开离子源到达质量分析器之前这一段无场飞行时发生裂解形成低质量的离子（由m1变成m2）所产生的峰，称为亚稳离子峰。这类离子具有质量为m1离子的速度,m2的质量。这类离子峰将不出现在m/z=m2处，而是出现在m/z=m*处，由下式计算122)(*mmm一般亚稳离子峰的峰形宽而矮小。m/z为非整数。LOGO五、质谱分析法应用通过解析质谱图，可以判断化合物的相对分子质量、确定化学式和结构式。通常已知化合物的质谱解析比较容易，而未知物的质谱解析比较困难。LOGO（一）相对分子质量的测定：利用分子离子峰的m/z可准确地确定该化合物的相对分子质量。一般来说，除同位素峰外，分子离子峰一定是质谱图上质量数最大的峰，位于质谱图的最右端，但是，某些化合物的分子离子峰稳定性差，分子离子峰很弱或不存在，全部为碎片离子峰，给判断分子离子峰带来困难，在判断分子离子峰时应注意以下问题：LOGO1、分子离子峰必须符合氮数规律：因为组成有机化合物的主要元素C、H、O、N、S、卤素中，只有N的化合价为奇数（3），而质量数为偶数（14）。氮规律：（1）含有偶数（包括零）N时，其分子离子峰的m/z一定是偶数。（2）含有奇数N原子时，其分子离子峰的m/z一定是奇数。凡不符合氮规律的离子峰一定不是分子离子峰LOGO2、利用碎片的合理性判断离子峰有机化合物受到电子轰击后，分子离子可以裂解出游离基或中性分子等碎片，若裂解出一个·H，两个·H，或·CH3、H2O、C2H4等碎体。对应的碎片峰为m-1、m-2、m-15、m-18、m-28等，这些是合理的碎片峰。若分子离子峰与邻近离子峰的质量差为4~13，21~25等为不合理。P272列出一些从分子离子中裂解的常见碎片。LOGO3、当化合物中含S、Br、Cl时，可利用M与M+2峰的比例来确定分子离子峰35Cl79Br32S的