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任课教师：吴雨龙任课班级：07级实验九小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测与结构观察实验九小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测与结构观察1.认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等生殖器官结构及位置特点；2.掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集方法；3.掌握血细胞计数板法精子计数和运动能力检查的方法；4.通过睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测，认识精子在睾丸产生后，在附睾内成熟的过程；实验目的5.掌握精子抹片方法；6.掌握染色法进行精子结构观察和顶体结构观察的方法，认识精子的正常结构；7.使学生得到小鼠精子操作的基础训练。实验目的哺乳动物的精子在睾丸内形成，并必须经过在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的变化而最终达到成熟，才能获得向前运动的能力，这种向前运动能力的获得是精子受精能力的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部两个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，实验原理头部顶端是顶体，顶体包围核的前端形成帽状。精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末端。实验原理1.设备与器材：实体显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、注射器、注射针头、吸管、试管架、血细胞计数板、剪刀、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片等。实验用品2.药品、试剂：精子操作液（CZB液或KSOM液）、0.5%龙胆紫酒精液、36%甲醛溶液、磷酸缓冲液（PH6.8）、精子固定液（福尔马林磷酸盐缓冲液）、吉姆萨工作液。实验用品3.实验动物：选择60日龄以上，体重达到32-35g的昆明种公鼠。1.精子采集：左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图3-1所示方法，以颈部脱臼法处死小鼠。使处死的小鼠仰卧，用75%的酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液的表面皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。实验方法将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，用眼科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、其余部分的输精管3部分，弃去附睾头。采集睾丸精子时，将睾丸横切为如干段或组织块，放在表面皿中，加1ml培养液，用眼科剪轻轻挤压睾丸组织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育20min，使精子自行散开。实验方法实验方法采集附睾尾精子时，将其剪成几段。采集输精管精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗管腔，将输精管放入含有1ml培养液的表面皿内，在实体显微镜下，用一只眼科异物针固定输精管，用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开，用吸管连同精子吸出液体部分，装于2ml具塞试管中暂存。2.精子运动能力检查：用滴管吸取精液，放于血细胞计数板的计数室与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。计数中间5个中方格（对角5个或四角及中间）内80个小方格的精子数，计数值为X0计算时，先计数死精子的X1值，然后计数板置于50℃水浴锅中的搪瓷盘中，在50℃条件下5～10min杀死精子，计数总精子数X2值，（X2－X1）/X2为表示精子运动能力的精子活力值。计数时每份精子用3个计数板重复计数3次，取平均值。实验方法3.精子整体结构观察：取1小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉的形式制成抹片。用0.5%龙胆紫酒精液染色3min，自然干燥，水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常的精子，部分为畸形精子，如头部畸形（如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等）、颈部畸形实验方法3.精子整体结构观察：（颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等）、尾部中段畸形（膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等）、尾部主段畸形，然后分类计数。有的精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可计为畸形精子。实验方法4.精子顶体结构观察：精液抹片自然干燥10～20min，以1～2ml的福尔马林磷酸缓冲液固定15min,水洗后自然干燥。用姬姆萨工作液染色90min，水洗，风干。置于1000倍显微镜下用油镜观察，计数顶体异常精子。镜下可观察到大多数精子顶体结构正常，部分精子顶体异常，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺损、部分或完全脱落。实验方法剖开小鼠腹腔时，剪刀头要向上，以避免剪破腹腔血管和内脏，影响实验结果的观察。实验注意事项实验结果及分析1.雄性小鼠的生殖器官主要由哪几个部分组成？2.绘制小鼠精子结构图？3.从外观上看小鼠精子由哪几部分组成？你都观察到了哪几种畸形结构？将典型的畸形结构进行图示。顶体缺损顶体脱落顶体空泡正常精子顶体结构