松材线虫病检测技术及普查方法

松材线虫病检测技术及普查方法湖北省森林病虫害防治检疫总站松材线虫病检测技及术普查方法松材线虫病简介松材线虫病检测技术松材线虫病普查方法分类地位松材线虫属垫刃目(Tylenehida)，滑刃科(Aphglenchoididae)伞滑刃属(Bursaphelenchus)。松材线虫病分布与危害松材线虫病是由松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus)寄生在松树体内而导致树木迅速死亡的一种毁灭性病害。美国早在1934年在路易斯安娜州一个锯木厂的长叶松中分离到的线虫。1972年日本的真宫和清原确定了松树萎蔫病的病原为线虫，并将其命名为松材线虫(Bursaphelenchuslignicolus)。目前分布于加拿大、墨西哥、日本、韩国、中国、葡萄牙、尼日利亚等多个国家，其中以日本受害最重。松材线虫病分布与危害我国自1982年在南京发现该病以来，目前此病害已分布于江苏、安徽、广东、广西、山东、浙江、湖北、湖南、重庆、福建、贵州、江西、云南、四川、陕西等15个省份(港澳台未统计在内）的部分松林。松材线虫病对我国森林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏。该病已列于我国森林病虫害之首。松材线虫病分布与危害该病危害的毁灭性在于致病力强，寄主死亡速度快；传播快，且常常猝不及防；一旦发生，治理难度大。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，对我国丰富的松林资源构成严重威胁。松材线虫病寄主松材线虫的寄主种类均为针叶树，其中以松属树种为主，非松属树种很少。据国内外资料记载，自然条件下感病的松属树种有36种，其中我国有9种：日本赤松(Pinusdensiflora)、日本黑松(P.thunbergii)、马尾松(P.massoniana)、白皮松(P.bungeana)、海岸松(P.pinaster)、火炬松(P.taeda)、黄松(P.thubergii×massoniana)、寄主湿地松(P.elliottii)、硫球松(P.luchuensis)；非松属树种有8种：香脂冷杉(Abiesbalsamea)、欧洲云杉(Piceaexcelsa)、加拿大云杉(P.canadensis)、北美云杉(P.pungens)、欧洲落叶松(Larixeuropaea)、美加落叶松(L.americara)、雪松(Cedrusdaeodara)、大西洋雪松(C.atlantica)等几十种松杉树上。(其中最容易感病的是黑松，在我省松材线虫病已发现在马尾松、黄山松、华山松三种松树上发生)。松材线虫病症状和发病过程松树受松材线虫侵染后，植株迅速枯死是松材线虫病的重要特点。被松材线虫侵染后，整个植株失水，蒸腾作用降低，同时树脂分泌急剧减少、停止。无论是对自然感病株还是人工接种株的观察，其外部症状都表现出针叶失去光泽，经过短时间灰绿、黄绿的过程迅速变为黄褐色，乃至红褐色，同时陆续从局部波及整个植株，最后整个植株枯萎、死亡。松材线虫病症状和发病过程受松材线虫侵染针叶当年不脱落。被松材线虫侵染后的植株木质部往往由于兰变菌的存在而呈现兰灰色。一般从出现外部症状至死亡约1—1.5个月。病株在显示外部症状之前9—14天，流脂量就显著下降到微量或根本无流脂。病害多在7、8、9月份流行。大多数病株当年死亡，少数翌年死亡。症状和发病过程根据症状及发病过程可以对松材线虫病进行初步诊断，进而可以取样进行线虫分离。在尚未出现外部症状之前可以根据流脂量的变化进行早期诊断。用手摇钻在高1—1.3m树干处钻一直径1cm的小洞，深至木质部，2小时后观察流脂情况。健康树流脂量大，树脂充溢，而病树流脂少，甚至无流脂出现。此外，发病时间和死亡速度也是很重要的诊断依据。当然，少数植株，或在温度较低地区的植株也可能当年感病，翌年死亡。松材线虫病症状和发病过程松材线虫病的重要特点是病树迅速死亡。根据病树的死亡时间，可将该病的症状分为三种类型：1.当年枯死型：多数情况下，植株感病后，于当年秋季表现全株枯死。在高温干旱时，植株从线虫侵入到枯死只需要3个月左右，从开始出现症状到死亡大约30-45天。典型病害症状的出现，大体上可分为4个阶段：松材线虫病1）病害初期，植株外观正常，但树脂分泌开始减少；2）树脂停止分泌，蒸腾作用减弱，树冠；部分针叶失去光泽、变黄，此时，一般能观察到天牛或其它甲虫侵害或产卵的痕迹；3）多数针叶变黄，植株开始枯萎，这时，可以发现甲虫的蛀屑；4）整个树冠针叶由黄色变为褐色或红褐色，全株枯死，针叶当年不落。发病4个阶段的典型病害症状第一阶段第二阶段发病4个阶段的典型病害症状第三阶段第四阶段松材线虫病症状和发病过程2、越年枯死型：在温度较低地区，有约10%松树感病后，当年不迅速枯死，而是次年春或初夏才枯死。3、枝条枯死型：在不利发病条件下，植株感病后，在1-2年时间内，并不表现全株枯死现象。一般仅为树冠上少量枝条枯死，随时间推移，枯死枝条逐渐增多，直至全株。松材线虫病生物学特征松材线虫由卵发育为成虫，期间要经过４龄幼虫期。雌、雄虫交尾后产卵，雌虫可保持30d左右的产卵期，１条雌虫产卵约100粒。在生长最适温度(25℃)条件下约4d１代，发育的临界温度为9.5℃，高于33℃则不能繁殖。由卵孵化的幼虫在卵内即脱皮１次，孵出的幼虫为２龄幼虫。秋末冬初，病死树内的松材线虫已逐渐停止增殖，并有自然死亡，同时开始出现另一种类型的３龄幼虫，称为分散型３龄虫，进入休眠阶段。第二年春季，当媒介昆虫松褐天牛将羽化时，分散型３龄虫脱皮后形成分散型４龄虫，特称为dauerlarvae(DL)，即休眠幼虫(耐久型幼虫)。松材线虫病生物学特征这个阶段的幼虫即分散型３龄、分散型４龄幼虫在形态上及生物学特性上都与繁殖阶段不同，如角质膜加厚、内含物增多、形成休眠幼虫口针、食道退化。这阶段幼虫抵抗不良环境能力加强，休眠幼虫适宜昆虫携带传播。松材线虫病生物学特征松材线虫的媒介昆虫松褐天牛在华东地区一般为１年１代；广东１年２－３代，以２代为主。在我们湖北地区１年１代，春天可见松材线虫分散型３龄虫明显地分布在松褐天牛蛀道周围，并渐渐向蛹室集中。这主要是由于蛹室内含有大量的不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕油酸等对线虫产生趋化活性。当褐松天牛即将羽化时，分散型３龄虫脱皮形成休眠幼虫，通过松褐天牛的气门进入气管，随天牛羽化离开寄主植物。松材线虫病生物学特征松材线虫对二氧化碳有强烈的趋化性，天牛蛹羽化时产生的二氧化碳是休眠幼虫被吸引至气管中的重要原因。在松褐天牛体上的松材线虫均为休眠幼虫，多分布于气管中，以后胸气管中线虫量最大。此外也会附着在体表及前翅内侧。１只天牛可携带成千上万条线虫，据记载最高可达280万多条。当松褐天牛补充营养时，大量的休眠幼虫则从其啃食树皮所造成的伤口侵入健康松树。松材线虫病生物学特征松褐天牛在产卵期线虫携带量显著减少，少量线虫也可从产卵时所造成的伤口侵入寄主。休眠幼虫进入树体后即脱皮为成虫进入繁殖阶段，大约以4d１代的速度大量繁殖，并逐渐扩散到树干、树枝及树根。被松材线虫侵染了的松树大抵是松褐天牛产卵的对象。翌年松褐天牛羽化时又会携带大量线虫，并接种到“健树”上，如此循环，导致松材线虫的传播。松材线虫病传播途径一是自然传播。在自然条件下，松材线虫的扩散主要是依靠传媒天牛的自然活动进行的。目前认为松材线虫从传媒天牛传播到寄主松树，传媒天牛携带松材线虫飞出病树后，在健康松树上补充营养取食时，松材虫从传媒天牛气管爬出，并从天牛取食时在松枝上造成的伤口侵入到松树体内。自然传播的速度是较慢的。松材线虫病传播途径二是人为传播。带有松材线虫和传媒天牛的病材、病枝及其加工制品等人为携带或运输工具等传入到另一地区。这种传播方式不受自然屏障限制，而且速度快，是最主要、也是最危险的传播方式。松材线虫病松材线虫、松天牛、松树三者之间的生物联系松材线虫和传媒天牛以松树寄主，离开了松树等寄主植物，松材线虫和传媒天牛在自然条件下很难长久存活，松材线虫和传媒天牛共同寄生在松树体内，两者为其共生关系。松材线虫、松天牛、松树三者之间的生物联系没有松褐天牛等媒介传播，松材线虫病很难转移危害，松材线虫使松树树势衰弱，流脂减少或停止，提高了传媒天牛卵及幼虫的成活率，使传媒天牛的种群增加，促进了松材线虫病的进一步扩展；传媒天牛、松材线虫不断地相互促进，加快了松林的毁灭速度。.带有传媒天牛和松材线虫病死木经人为传播和传媒天牛迁飞，造成新的疫点和新一轮侵染循环。接种28天后的黑松苗和对照（倒“T”法）病害发展过程2-(1)7月9日病害发展过程2-(2)8月7日松材线虫为害状（马尾松）松材线虫为害状（黑松）松材线虫病松天牛的分布及生物学在亚洲无论是我国，还是日本和韩国，松材线虫最重要的传播媒介均为松褐天牛。在日本已发现9种天牛携带松材线虫，除松天牛外还有：(M.nitens)(白斑墨天牛)、(Acaloleptafraudatrix)(锦天牛的一种)、(Arhopalusrusticus)(褐幽天牛)、(Corymbiasuccedanea)(红花天牛的一种)、(Uraechabimaculata)(双斑泥色天牛)、(Spondylisbuprestoides)(短角幽天牛)、(Acanthocinusgriseus)(小灰长角天牛)。松材线虫病松天牛的分布及生物学此外，在北部地区分布较多的(M.saltuarius)(云杉花黑天牛)与当地松材线虫传播有关。在美国发现携带松材线虫的天牛有：(M.Carolinensis)(卡墨天牛)、(M.scutellatus)(白点墨天牛)、(M.titilator)(南美松墨天牛)、(M.obtusus)、(M.mutator)和褐幽天牛等。但其中只有松褐天牛是重要的传播媒介。松褐天牛的各种虫态。松褐天牛雌虫（左）和雄虫（右）松褐天牛正在取食松树嫩枝。松树嫩枝被松褐天牛取食的痕迹。12松褐天牛产卵刻槽（下）和羽化孔（上）被松褐天牛和松材线虫为害致死的松树木段。松材线虫病检测技术直观检查在林中进行病害调查时，观察病株是否具有松材线虫病外部症状，即针叶变为黄褐色乃至红褐色，植株干枯，媒介昆虫或其栖居痕迹，诸如取食痕迹、产卵痕、侵入孔、羽化孔等。在调运检疫时直接和借助于锯、斧等工具对应施检疫物根据来源观察是否存在木质干枯、木质部兰变和媒介昆虫或它的栖居痕迹等症状。松材线虫病检测技术室内检验a、抽样和取样：在调运检疫时抽取有上述症状的部分检疫物，抽样数量为每批次总件数的0.5-5.0%，但最低不得少于5件。若无明显症状时可随机抽样。在进行病害调查时，则选取有松材线虫病症状的样株，根据具体情况砍取木段或钻取木屑进行室内检验。松材线虫病检测技术在所选取的样木（样品）或样株上钻取少量木屑约10g，每样3个重复。取样时要注意选取靠近蛀道、蛹室的部位，所取样品不得带有树皮。对所取样品标号后带回实验室检验。必要时可将整件样木(或样品)带回实验室备检。b、分离线虫：将各标号样品分别进行线虫分离。松材线虫病检测技术分离线虫可采用贝尔曼(Baermann)漏斗法或浅盘法。对媒介昆虫进行线虫分离时，可将其用剪刀或尖头镊子、解剖针等剪碎或撕碎后同样采用上述方法进行。分离时若室温较低(不得低于7℃)可根据室温高低将分离用水调至20—40℃(不得超过40℃)后浸泡分离材料，3—4小时线虫游离出一定数量后即可镜检。一般情况24小时后镜检。松材线虫病检测技术贝尔曼(Baermann)漏斗法：将大小适当(直径10—15cm)的漏斗末端接一段长约10cm的乳胶管后置于漏斗架上，在乳胶管上装一止水夹。剪大小适当纱布两层铺在漏斗上。将带到实验室的样段去皮后劈成长约3—4cm的细条或钻取木屑，约取小木条(或木屑)10g置于漏斗上的纱布中，将纱布四角向中间盖上分离材料，然后松材线虫病检测技术注入清水浸没。注入清水后要注意使水充满漏斗和下面的乳胶管，不要产生空隙。镜检时，用培养皿在漏斗末端接取线虫分离液约5—15ml即可。贝尔曼(Baermann)漏斗法分离线虫浅盘法分离线虫松材线