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实验四、伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。一、实验目的1.了解ELISA的原理和类型2.掌握阻断ELISA操作程序二、实验原理1.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；2.抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；3.酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。间接法（IndirectELISA）阻断法（BlockELISA)双抗体夹心法（SandwichELISA)竞争法（CompetitiveELISA)（1）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量。显色间接ELISA（2）阻断法测定抗体A.将抗原吸附在固相载体表面;B.先加待检血清（抗体）,形成抗原-抗体复合物;C.再加酶标单抗；D.加底物。单抗血清？底物显色阻断ELISA（3）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）竞争法测定抗原A.抗体吸附在固相载体表面;B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。1.酶标板，酶标仪2.包被缓冲液：0.025MpH9.6碳酸盐缓冲液3.猪伪狂犬病毒（PRV）——抗原4.样品稀释液：pH7.4PBS三、实验材料4.阴性对照（EP管中，已稀释）5.阳性对照（EP管中，已稀释）6.样品——待测猪血清（EP管中，已稀释）7.AP标记猪PRV单抗——酶标单抗（EP管中，已稀释）8.洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS（青瓶）常用酶及底物常用酶底物反应后颜色辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（OPD）棕黄色碱性磷酸酶（AP）四甲基联苯胺（TMB）蓝色9.底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液10.底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30%H2O2，新鲜配制11.终止液1.抗原处理：2.抗原包被：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次四、实验方法3.加待测血清：标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性待测阳性待测4.加单抗：37℃，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100μL/孔37℃，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min,加终止液1滴6.观察结果1.取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温育30分钟。2.洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。3.每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。4.洗板：同步骤2。5.显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25℃）避光显色10分钟后。6.终止：每孔加终止液1滴(50μl)（0.25%氢氟酸），终止反应。7.10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。8.结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。9.S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值10.如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性;11.如果S/N比值≤0.7但0.6，样品可疑;12.如果S/N比值0.7，样品判定为PRV抗体阴性。五、结果与分析1.阴阳性对照样品的OD630＝?2.S/N＝?，被检血清是阴/阳性？3.结果与预期的不符，可能的原因是什么？预期结果阳性：无色阴性：蓝色1234阳性阳性阴性被检单抗血清？底物显色被检？？1.ELISA前血清样品37℃灭活30分钟。2.在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。3.加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。4.实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。六、注意事项思考题1.间接ELISA和阻断ELISA有什么异同？2.伪狂犬的抗体检测方法还有哪些？