探索DNA的无限可能

TM探索DNA的无限可能TwistAmp®LiquidDNA扩增试剂盒综合说明书TwistAmp®LiquidBasic/BasicRTTwistAmp®Liquidexo/exoRT2仅供体外使用。仅供研发使用。不得做诊断之用。3目录内含材料、储存条件4购买者须知5简介6TwistAmp®扩增技术概述6TwistAmp®反应条件6TwistAmp®Liquid应用系列9TwistAmp®分析开发10TwistAmp®LiquidBasic/BasicRT试剂盒11方案12详细实验方案14TwistAmp®Liquidexo/exoRT试剂盒22其他必需材料23详细实验方案25参考文献、尾注、SDS信息324内含材料、储存条件标配材料•250µL20xCoreReactionMix•3mL2xReactionBuffer•500µL280mM醋酸镁(MgOAc)•550µL10xE-mix（“Basic”或“Probe”，取决于试剂盒）特定试剂盒的材料•100µL50x核酸外切酶III（TwistAmp®Liquidexo/exoRT试剂盒）•100µL50x逆转录酶(RT)（TwistAmp®LiquidBasicRT/exoRT试剂盒）•100µL阳性对照模板（随TwistAmp®Liquidexo/Basic试剂盒提供的DNA，随TwistAmp®LiquidBasicRT/exoRT试剂盒提供的RNA）•45µL阳性对照寡核苷酸混合物（Basic/BasicRT试剂盒中的该寡核苷酸混合物由引物组成，exo/exoRT试剂盒中的该寡核苷酸混合物由引物和带荧光标记的exo探针组成）其他必需材料（试剂盒中未提供）•分子级的水•dNTP•特定分析用的寡核苷酸•RNase抑制剂（与RT试剂盒结合使用）储存条件TwistAmp®Liquid试剂盒组分：到货后储存于-20°C下（全活性可保持6个月）。2xReactionBuffer：到货后分装并储存在-20°C下（全活性可保持6个月）。避免冻/融次数过多。通过在到货后或在第一次解冻后进行分装便可避免。阳性对照寡核苷酸混合物和DNA模板：到货后储存在-20°C条件下；最多可进行5次解冻-再冷冻循环（全活性可保持6个月）。阳性对照RNA模板：到货后应储存在-80°C下。5购买者须知许可、使用限制和责任限制定义。在本部分中，“试剂盒”是指本手册（以下简称“手册”）中所述的由TwistDx向购买者（以下简称“接收者”）提供的物品。“材料”是指作为本试剂盒的一部分提供的所有生物和化学材料。“信息”是指作为本试剂盒的一部分提供的所有书面信息、通过TwistDx网站提供的与试剂盒相关的信息，以及TwistDx的任何员工或代理提供的与本试剂盒或其使用有关的任何口头或书面信息。材料和信息的使用及分发限制接收者确认并同意，材料和信息是TwistDx的专有财产，可能受到TwistDx或其附属机构拥有的专利要求书或专利申请的保护，其供应有以下限制：材料和信息以非排他性方式授权给接收者，仅用于非商业性内部研究目的，以及在测序设备上鉴别序列和测定其相对顺序时，单次运行中的总靶标核苷酸数量不得达到200,000。明确禁止将材料和信息用于任何体外诊断用途，或用于诊断或监测人体的任何病况。无保证；责任限制接收者了解并同意，材料属于实验性质，提供材料和信息时未就结果、适销性、特定用途适用性或不侵犯任何专利或其他知识产权提供任何保证，也未提供任何其他明示或暗示的声明、保证或条件。TwistDx对基于任何合同、疏失、严格责任或其他论据提出的，与材料、信息或违反本协议有关的以下损失、费用或损害赔偿概不负责：(a)收入损失、利润损失，数据（包括检测结果）丢失或不准确，不管如何描述此类损害赔偿；(b)替代商品、服务或技术的费用（包括采购费用），或(c)任何特殊、间接、附带或后果性损害赔偿。任何情况下，TwistDx在本协议下的累积责任不超过一百美元(US$100)。接收者了解，其将材料和/或信息用于其活动中须自行承担全部风险。6简介TwistAmp®DNA扩增试剂盒提供所需试剂用于将核酸模板材料从痕量水平扩增到可检测水平（从单个模板分子扩增到约1012个分子的扩增产物）。该技术的生物化学基础是聚合酶与DNA重组/修复蛋白（包括重组酶）的组合。得到的酶混合物在低温下（最佳约37-42°C）具有活性，能够通过寡核苷酸引物特异性地识别模板靶位点的序列，随后发生DNA的链置换合成，从而使模板中的靶区域呈指数扩增。在多数情况下，使用TwistAmp®试剂盒进行扩增时扩增速度非常快（最佳条件下），产物可在10分钟内达到可检测水平。TwistAmp®扩增技术概述TwistAmp®等温扩增技术的基础是TwistDx™开发的重组酶聚合酶扩增(RPA)过程（请参见第38页）。对RPA扩增产物可在终点进行检测，也可进行实时检测，检测方法多样，其中包括凝胶电泳法、基于探针的荧光检测法或者简便的免仪器“夹心分析”法，例如横向流动试纸条。RPA过程采用了称为重组酶的酶，其原型是大肠杆菌recA，该重组酶可结合单链核酸骨架（在本扩增技术中为标准寡核苷酸），并刺激形成的蛋白质-DNA复合物寻找双链DNA中的同源序列。找到同源序列后进行链置换反应，寡核苷酸与其互补链配对，以便聚合酶从3'末端启动合成过程。TwistAmp®扩增过程使用两个方向相反的寡核苷酸引物来启动每起合成事件。以类似于PCR的方式为靶标设计的这些引物可实现指数级的扩增过程。TwistAmp®反应条件和所有DNA扩增体系一样，除了选择好的扩增引物和靶标外，还有很多其他方法可以优化RPA反应条件。改变反应组分浓度可影响多个反应参数，这些参数包括但不限于动力学、产物长度最大值以及最佳反应温度。但为了简化最终用户的操作，目前TwistAmp®试剂盒经过专门配制而具备了以下整体性能特征：•扩增速度非常快（在大多数情况下，在10-12分钟内达到可检出水平）•扩增子长度小于500bp•最佳温度为37°C-42°C7注：20xCoreReactionMix含有大肠杆菌DNA杂质。如果大肠杆菌中存在与菌株K12及Bl21（用于生产我们的蛋白质）同源的序列，则不适合使用RPA反应来开发这些大肠杆菌的诊断检测。通过改变条件，扩增能够以更慢的动力学进行以便于定量，能够生成更长的扩增产物（最高2kb），还能够在显著更低的温度下有效运行。相关方如需了解有关TwistAmp®反应条件优化的进一步论述，请参阅twistdx.co.uk上的TwistAmp®分析设计手册。对于TwistAmp®析设计手册中未论及的专业需求和应用，请通过技术支持中心联系TwistDx™，技术支持中心电子邮箱为[e-mail]81.重组酶-寡核苷酸引物复合物形成并靶向识别同源DNA。2.SSB蛋白与被置换的链结合，使形成的D环保持稳定。3.链置换聚合酶启动合成。4.母链分开，合成继续。5.形成两个双链体。寡核苷酸引物重组酶单链DNA结合(SSB)蛋白聚合酶图1RPA循环9TwistAmp®Liquid应用系列针对不同的应用和检测模式设计了许多不同的配方。TwistAmp®LiquidBasic含有DNA扩增所需的所有酶和试剂，用户只需自行准备引物、模板和dNTP。通常采用终点检测法（例如凝胶电泳）来评估是否扩增成功。还可以纯化扩增所得材料并用于下游应用（例如亚克隆）。TwistAmp®LiquidBasicRT专用于以RNA模板作为起始材料进行一步法扩增。它包含®LiquidBasic试剂盒的试剂组分（见上文）以及相容的逆转录酶，该酶用于将起始RNA模板转换为DNA，从而生成扩增底物。TwistAmp®Liquidexo将TwistDx™扩增技术与TwistDx™专有的TwistAmp®exo荧光探针相结合。除了基本的组分，该试剂盒还包含强大的核酸酶（核酸外切酶III），该酶将在扩增反应期间处理TwistAmp®exo探针并产生实时读数。核酸外切酶III的存在会使终点时扩增子的最终总产量减少，导致不适合进行凝胶电泳检测，但它特别适用于在RPA体系中产生强荧光信号动力学。TwistAmp®LiquidexoRT专用于以RNA模板作为起始材料进行实时定量一步法扩增。它包含TwistAmp®Liquidexo试剂盒的试剂组分（见上文）以及相容的逆转录酶，该酶用于将起始RNA模板转换为DNA，从而生成扩增底物。10TwistAmp®分析开发有关所有TwistAmp分析设计的完整说明，请参阅twistdx.co.uk上发布的单独TwistAmp®分析设计手册。目前RPA尚没有适用的自动引物设计软件，因为我们仍在探索最佳设计。我们不建议在RPA分析中使用PCR引物设计软件，因为这类软件主要使用解链温度(Tm)来确定良好的引物对。由于RPA反应中不会发生热解链（一切由酶催化完成），我们不知道Tm与RPA引物性能有多大关系（如果有的话）。一些RPA用户通过在设计软件中将默认引物长度更改为32-36个碱基并忽略Tm参数，成功开发出了合适的引物。对于最敏感的引物，我们建议遵循TwistAmp®分析设计手册中的指南。使用荧光团/淬灭团探针进行实时检测能够非常便利地监测TwistAmp®反应中的扩增事件。探针特别适用于快速生成不同引物对之间的速度及灵敏度对比数据，因此是用于筛选潜在候选引物的有用工具（请参见TwistAmp®分析设计手册第2节）。TwistAmp®exo寡核苷酸探针与TwistAmp®exo试剂盒相容。这些探针经设计通常与扩增子上位于主扩增引物之间的区域具有同源性。关于此专利性探针设计，请参见TwistAmp®分析设计手册，该手册中包括有关结构、功能、长度、位置的指南以及设计示例。可使用TwistDx™TwistAmp®寡核苷酸订购表（可在twistdx.co.uk上获取），从各寡核苷酸制造商处订购TwistAmp®探针连同分析引物。11TwistAmp®LiquidBasic/BasicRT试剂盒TwistAmp®LiquidBasic/BasicRT试剂盒12TwistAmp®LiquidBasic/BasicRT试剂盒在开始之前：TheTwistAmp®扩增过程需要使用合适的寡核苷酸引物才能进行有效扩增。为特定PCR分析而设计的引物虽然通常也适用，但该引物可能不是TwistAmp®反应的最佳选择。表现出快速扩增动力学的TwistAmp®引物通常比典型的PCR引物长，而且与PCR相比，寡核苷酸的解链温度对于其作为引物的性能而言或许并不是最关键的因素。用户应通过筛选流程为要执行的扩增确定合适的TwistAmp®引物（请参见twistdx.co.uk上的TwistAmp®分析设计手册）。其他必需材料•dNTP•扩增引物•分子级的水•Rnase抑制剂（如果扩增RNA模板）•微量恒温仪或其他恒温孵育箱•DNA片段纯化试剂/设备•琼脂糖凝胶电泳装置•试剂快速离心用的微量离心机方案试剂盒组分储存注意事项在合适的条件下，TwistAmp®Liquid试剂盒组分可以进行长期储存（可达6个月，但储存更长时间也可能保持稳定）。解冻后，应在使用前混合所有组分。TwistAmp®Liquid20xCoreReactionMix和其他酶以50%甘油储备液的形式提供，因此应储存在-20°C或更低温度下（如果储存在低于-20°C的温度下，则分装成较小的体积以避免反复冻融）。10xBasicE-mix应储存在低于-20°C的温度下。TwistAmp®Liquid2xReactionBuffer以各3mL小份的形式提供。1213TwistAmp®LiquidBasic/BasicRT试剂盒注：可以根据所需的样本数量，将所有这些样本所需的试剂盒组分混合成预混液。对于TwistAmp®Liquid反应，这些组分的混合顺序至关重要。添加顺序取决于您是要尝试扩增多个模板，还是要筛选多个引物组合。这是因为引物和探针应同时添加到20xCoreR