dgh呼吸系统疾病动物模型

中南大学湘雅基础医学院病理生理学系邓恭华第六章呼吸系统疾病动物模型一、慢性支气管炎概述慢性支气管炎(chronicbronchitis)：指由感染或非感染因素引起的气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎性反应。第一节慢性支气管炎动物模型1.慢性支气管炎的定义：2.慢性支气管炎的特点：2)咳痰或伴有喘息反复发作，每次持续3个月以上，连续2年以上的慢性病理过程。3)严重时可并发肺气肿或肺心病。4)初期症状较轻，常在冬季发病，春季转暖后症状缓解。晚期病性加重，季节性表现不明显，可常年存在。1)发病以老年人居多。3.慢性支气管炎的病因：1)吸烟：长期烟民2)感染：各种病原菌3)理化因素：刺激性烟雾、毒气、粉尘、二氧化硫气体等。4)气候因素：寒冷5)过敏反应6)呼吸道局部防御及免疫功能降低7)自主神经功能失调二、慢性支气管炎造模方法1.吸入毒气方法造模有毒气体造模方法造模时间总观察时间含2%SO2的空气每天1次，每次吸气10秒连续14-18天为轻度，连续27为重度97天含0.001-.004mg/LCl2的空气每天1次，每次吸气25-30分钟连续35天后可出现慢性支气管炎症状50天含氨气的空气第天8次，每次吸气2-3分钟，每次间隔15-20分钟连续32天后可出现慢性支气管炎症状100天（一）吸入单一有毒气体法2.吸入SO2法的特点1)小鼠出现刺激性咳嗽，体重不增，少数死亡。2)支气管病理改变：早期为急性炎症，12天后出现淋巴细胞、浆细胞浸润，继而支气管周围结缔组织增生，27天后显示为重度慢性支气管炎。3)支气管腔内粘液阻塞，气管上皮坏死，杯状细胞和气管平滑肌增生，肺泡腔扩大，部分肺泡融合成肺大泡。此法还可观察到：气道和肺组织毒蕈碱型受体(M受体)及功能改变。3.吸入SO2法的优、缺点和应用优点：1)此法稳定可靠，成功率高，为最常用的慢性支气管炎模型；2)需要观察气道和肺组织毒蕈碱型受体(M受体)及功能改变的，吸入SO2法最好。缺点：1)此法需要每天检测SO2浓度，所需设备和操作复杂，耗时费力。2)SO2为有害气体，吸入后动物发生严重气道内病变，常导致动物死亡。应用：最常用的慢性支气管炎动物模型1.吸入烟雾方法造模有毒气体造模方法造模时间含混合烟雾的空气将大鼠置于27m2的烟室内制烟，每天制烟1次，每周6次。连续44天含香烟烟雾的空气将豚鼠置于21L容器中制烟，每天烟熏2次，每次10分钟，每周烟熏6天。同时，置于7-8℃环境中，每次1小时，隔天1次。45天后改为每周2次。连续28-35天后轻度，42天后可出现重度慢性支气管炎症状（二）吸入烟雾法2.吸入烟雾法的特点1)随着吸入烟雾时间延长，气管炎病变逐渐加重，至第7周形成慢性支气管炎典型改变。2)气管炎症细胞特点：初期以巨噬细胞为主，随后以淋巴细胞为主，中性粒细胞仅在接触烟雾的早期短时间内升高。3.吸入烟雾法的优、缺点和应用优点：1)此法简单易行，合并出现其它疾病情况少。2)此法起病较缓，可以反映慢性支气管炎早期炎症形成的系列过程。缺点：烟雾吸入(烟熏)法需要较长时间，考验耐心。应用：特别适用于研究慢性支气管炎发生发展过程中需要探讨不同阶段的病理变化及相应的炎症细胞的浸润、炎性标志物的变化。1.病菌滴鼻的方法造模菌液造模方法造模时间流感病毒液，1：320；或者流感杆菌液，7×108个/ml小鼠乙醚麻醉后，将菌液(0.03ml/只)滴鼻，每天1次连续3-6天后，支气管上皮轻度坏死，连续35天后，典型慢支症状4种细菌混合液3%戊巴比妥麻醉大鼠，将混合菌液(0.1ml/只)滴鼻，每周1次连续6周后可出现轻度慢支症状寒冷环境及8种细菌混合液将豚鼠置于7-8℃环境中，每次1小时，隔天1次。45天后改为每周2次。同时，8种细菌混合液(0.2ml/只)滴鼻。150天后可出现慢性支气管炎症状（三）病菌滴鼻法2.病菌滴鼻法的特点1)更接近于临床实际情况2)感染2天后小鼠出现毛松、咳嗽、食欲缺乏等3)感染3-6天后出现气管上皮轻度坏死，杯状细胞数目初期下降，约10天后逐渐升高4)感染35天后出现典型的慢性支气管炎症状5)感染50天后逐渐恢复正常3.病菌滴鼻法的优、缺点和应用优点：1)由于采用病原菌摸拟临床感染状况，故更接近临床实际情况2)由于呼吸道感染病源菌众多，故采用最合适的病菌滴鼻，对探讨不同病源菌导致慢性支气管炎的发病机制有很的应用价值。缺点：1)致病菌混合的制备有一定难度2)不同致病菌引起的慢性支气管炎有较大差异2)可能导致研究人员的感染应用：主要适用于探讨慢性支气管炎病因（不同致病菌）、诱因，以及要求模拟临床实际情况的实验研究1.气管内滴注内毒素的方法1）将大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；2）仰卧位固定，拉出舌体，暴露声门，快速将套管穿过声门，插入气管；3）将内毒素（浓度200μg/200μl）注入气管；4）大鼠饲养3－4周后，逐渐出现慢性支气管炎表现。此法由于要做全麻手术和气管插管，比较麻烦，对大鼠损伤也大。（四）气管内滴注内毒素法2.气管内滴注内毒素法的特点1)用毒素代替致病菌，克服了致病菌混合液难制备的问题2)气管滴注脂多糖(LPS)约21天后，小鼠出现倦怠、毛发失泽、进食和饮水均减少3)支气管病理改变：气管、支气管上皮脱落，杯状细胞及粘液腺细胞增生，慢性炎症细胞浸润，平滑肌细胞增生肥大，管壁增厚4)支气管腔内充满粘液及大量中性粒细胞3.气管内滴注内毒素法的优、缺点和应用优点：1)克服了致病菌混合液难制备的问题2)避免了导致研究人员感染病菌的风险3)不需要象SO2吸入法那样，天天测SO2浓度缺点：1)当滴注LPS过量时，可能会导致内毒素血症，引起急性肺损伤。这与复制慢性支气管炎疾病模型思路相冲突2)不象致病菌滴鼻法那样贴近临床，已经与临床实际情况有较大差异3)需要做全麻手术和气管插管，比较麻烦，对大鼠损伤也大应用：适用于嫌病致菌制备难，天天测SO2麻烦，专注于慢性支气管炎发生发展机制研究例一、构建熏烟致慢性支气管炎小鼠模型结论一、支气管哮喘概述支气管哮喘(bronchialasthma)：指由于某些过敏因素引起的以支气管阻塞为特点的疾病。1.支气管哮喘的定义：2.哮喘的特征：阵发性带有哮鸣音的呼吸困难、咳嗽、咳痰，且反复发作。一般春、秋二季发病率较高，20%患者有家族史。第二节支气管哮喘动物模型3.支气管哮喘的危险因素：1)吸入性过敏原：花粉、真菌；尘螨、动物毛发及排泄物等2)食入性过敏原：鱼虾等水产、海产品；牛奶、鸡蛋、花生等3)呼吸道感染4)药物5)工业粉尘、化学气体或蒸气6)冷空气、过度通气、运动7)强烈情绪变化4.支气管哮喘发作的时相：患者在接触过敏原后几分钟内，出现哮喘发作的症状，最大呼气流速显著降低，一般持续2～3小时后即可恢复，称为哮喘的速发相反应。其机制与Ⅰ型变态反应有关。有一部分病人在速发相之后紧接着出现第二次哮喘发作，症状更重，持续时间更长，可达10小时甚至几天，重症者持续几十天，称为迟发相反应。其机制与气道过敏性炎症有关。过敏性哮喘的临床过程可分为速发相反应和迟发相反应两个阶段。病人可发生双相反应，也可只发生速发相或迟发相反应。儿童哮喘的迟发相反应要比成人多。二、支气管哮喘造模方法（一）致敏源诱发的哮喘模型动物造模因素致敏方法诱发哮喘时间与观察时间小鼠20g左右1号卵清蛋白抗原液腹腔注射1号卵清蛋白抗原液1次，每次0.2ml;8天后重复注射1次第15天起将小鼠置于密闭容器中，以60g/L卵清蛋白液雾化激发，每天1次，每次30分钟，连续7天，直至哮喘样发作大鼠120-180g2号卵清蛋白抗原液腹腔注射2号卵清蛋白抗原液1次，每次1ml;7天后重复注射1次2周后起将大鼠置于密闭容器中，以1%卵清蛋白液雾化激发，每天1次，每次30分钟，连续2周，直至哮喘样发作豚鼠300-500g1%卵清蛋白生理盐水溶液腹腔注射1%卵清蛋白生理盐水溶液1次，每次10ml2周后起将豚鼠置于密闭容器中，以1%卵清蛋白生理盐水溶液雾化激发，每天1次，每次20分钟，直至哮喘样发作1.方法2.致敏源诱发的哮喘特点小鼠：1)常用小鼠品系有：BALB/c品系较易产生气道高反应，并产生高滴度IgE；而C57BL/6品系不易出现气道高反应，且只产生低滴度IgE。大鼠：1)常用大鼠品系有：BrownNorway(国外)；SpragueDawley，Wistar(国内)。2)哮喘激发后3-5分钟发生速发相反应，2-4小时发生迟发相反应，随后出现肺部炎症细胞(24小时内主要是嗜酸性细胞)浸润。3)哮喘发作24小时内气道反应性升高，增幅为7-10倍，持续4-5天。多次激发能延长气道高反应性持续时间。4)能出现与人类哮喘类似的迟发相反应，并有嗜酸性细胞浸润和气道反应性增加。豚鼠：1)很容易致敏，并激发产生Ⅰ型变态反应。2)激发后的急性气道过敏反应，包括速发相和迟发相哮喘反应。3.致敏源诱发的哮喘模型优、缺点和应用优点：1)卵清蛋白来源容易，且价格低廉。2)卵清蛋白免疫原性强，容易致敏和激发哮喘。3)是国内外最常用的哮喘疾病模型。以下分别列举：小鼠、大鼠和豚鼠支气管哮喘模型的优点、缺点和应用优点：小鼠便宜，价格低，有利于大规模实验。小鼠哮喘模型优、缺点和应用缺点：1)几乎所有暴露于变应原(过敏原)的小鼠都可产生哮喘，故小鼠哮喘模型不宜应用于基因多态性研究。2)小鼠与人类存在呼吸系统的解剖、生理学上的差异。呼吸频率快，但潮气量低。3)小鼠与人类还存在免疫学机制上的差异。大多数小鼠哮喘模型会出现过敏性肺泡炎和超敏性肺炎，而掩盖了气道病变。应用：适用于需要大规模实验的情况，如:评价预防效果或哮喘疗效。大鼠哮喘模型优、缺点和应用优点：1)大鼠品系纯且全，易于繁殖，获得容易。2)价格较便宜，能减轻研究经费压力。3)与小鼠相比，可获取的标本量大很多。4)大鼠生物学特性与人有较多的相似性。缺点：1)国际上哮喘研究论文主要采用BrownNorway品系大鼠，但其价格较贵。BN大鼠哮喘模型的主要优势在于能产生针对吸入性变应原的特异性IgE抗体，且更易诱发哮喘症状、明显的气道炎症和气道高反应性。应用：1)是最常用的哮喘动物模型之一。2)适用于皮质激素治疗哮喘作用机理研究，以用非皮质激素类抗哮喘免疫抑制剂的疗效观察和评价。豚鼠哮喘模型优、缺点和应用优点：1)豚鼠价格较便宜；体型较大，方便实验操作；获取标本量大。2)变应原诱发的支气管哮喘与人类支气管哮喘中的气管收缩特点相同。包括：接触抗原后的支气管收缩反应；气道对介质的高反应性；以及嗜酸性细胞浸润的特征。缺点：1)由于近交系豚鼠罕见，不利于用来研究遗传因素的影响。2)皮质激素对豚鼠哮喘模型的支气管痉挛影响不显著。3)可能出现种群依赖性的夸大反应，如：过敏性休克，导致豚鼠死亡。应用：1)是使用最广泛的变应原性支气管哮喘模型。2)致敏性豚鼠的过敏性支气管收缩(包括速发相和迟发相)在研究抗过敏药、支气管扩张药药物疗效方面就用非常广泛。（二）甲苯二异氰酸甲酯(TDI)诱发的职业性哮喘模型1.TDI诱发哮喘方法动物造模因素致敏方法诱发哮喘时间与观察时间豚鼠250-300g/只TDI/BSA抗原腹腔注射TDI/BSA抗原1次，每次0.5ml；2-3周后再重复加强免疫1-2次，致敏在初次免疫5-8周后，做抗原激发试验。先用1%BSA激发，无反应后再用TDI/BSA激发。约有30%豚鼠会出现明显哮喘反应。2.TDI诱发哮喘特点1)经TDI/BSA激发后，动物呼吸频率加快、幅度增大，哮喘时伴有咳嗽、躁动不安，甚至出现痉挛性呼吸。2)85%动物可同时出现不同滴度的抗原特异性IgE、IgG抗体。3)TDI是重要的职业性致哮喘化学品之一。3.TDI诱发哮喘优点、缺点和应用优点：是TDI致职业性哮喘的重要动物模型。从事TDI作业者中约有5%-10%的人可发生职业性哮喘。缺点：1)TDI/BSA抗原制备难度大，步骤繁锁。2)属职业性哮喘，应用范围窄。应用：适用于TDI职业性哮喘方面研究。（三）邻苯二甲酸酐(PA)诱发的哮喘模型1.PA诱发哮喘模型方法动物造模因素致敏方法诱发哮喘时间与观察时间豚鼠25