病毒的分离鉴定

病毒分离鉴定与常用序列分析软件简介云南省地方病防治所病毒立克次体病防治科冯云E-mail:[e-mail]2012.5.30一、病毒的分离标本的处理蚊虫；蜱；蠓等；血清；脑脊液等；动物组织标本（脑，肺，脾等）病毒的分离动物接种组织培养鸡胚培养蚊虫饲养分离病毒“全程冷链”1．动物接种动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差异；接种途径：•脑内接种•皮下接种•皮内接种•腹腔接种•肌肉接种•静脉接种实验动物的观察：动物的发育、活动力、食欲和粪便特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、瘫痪、抽搐等直至死亡有些实验还需测量动物的体温和体重（1）原代和次代细胞培养（2）二倍体细胞培养（3）传代细胞培养（4）病毒在培养细胞中增殖的指标1）细胞病变2）红细胞吸附3）干扰现象4）细胞代谢的改变组织培养分离法：没有隐性感染没有免疫能力的抵抗力接种量大培养条件易于控制加速病毒的分离过程汉坦病毒敏感的培养细胞首先发现人肺癌细胞（A549）其他敏感细胞：Vero-E6、2BS、RL、CEC等2．组织培养细胞病变（CPE）：1、分布均匀的小颗粒状破坏病变；2、局灶状小颗粒状破坏；3、细胞圆化，呈局灶性葡萄状的堆积；4、细胞融合。圆缩；脱落；聚集；破碎；3．鸡胚培养优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁殖量较高；来源方便、经济，管理方便；缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；4．蚊虫分离病毒法经口感染胸腔接种优点：病毒可长时间保存在蚊体内；蚊虫饲养较实验动物容易，数量大；缺点：必须经常了解蚊子体内是否确已带毒；强调点：实验室生物安全实验室安全是重中之重，如果实验室的条件不具备，建议不要开展病毒分离工作；在进行相关实验的时候一定要严格按步骤操作；实验过程中一定要做好严格防护。1）蚀斑（plaque）测定可进行病毒的分离纯化；蚀斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定（一）病毒的数量与感染性测定二、病毒的鉴定结晶紫染色中性红染色1）病毒核酸类型的测定2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等3）血清学鉴定ELISA；IFA；（二）病毒理化性质及血清学鉴定阳性分离物上清提取总RNA反转录合成cDNA直接测序或克隆测序PCR扩增（三）病毒分子生物学鉴定什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。PCR技术的工作原理PCR操作过程1、预变性（Initialdenaturation）：模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟；2、引物退火（Primerannealing）：退火温度一般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有较大影响；3、引物延伸（Primerelongation）：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩增片段长短而定；4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产生非特异条带；6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。PCR的各种变体反向PCR（InversePCR，IPCR）不对称PCR（AsymmetricPCR）多重PCR荧光定量PCR（Q-PCR）反转录PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR）巢式PCR（NESTPCR）递减PCR（TouchdownPCR）可用于mRNA的半定量分析反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。1．反转录PCRTrans反转录酶系列常用于mRNA的定量分析实时定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。2．实时定量PCRSYBRGreen实时定量PCR分析原理示意图*目前有5种技术用于实时定量PCR其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBRGreen）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加；其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法，它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，但是成本较高。3.DNA芯片技术DNA芯片（DNAchip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。基因芯片工作流程三、生物信息学是预测基因组结构和功能的重要手段数据库的建设：汇集了大量DNA序列、蛋白质信息预测基因、基因产物的结构、功能；分析基因-基因、基因-产物、产物-产物之间的相互作用或联系；描述细胞或整体水平的基因表达谱；推测系统发生关系。人类X染色体图谱•NCBI数据库NCBI首先创建GenBank数据库•于1991年开发了Entrez数据库检索系统，该系统整合了GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等数据库的序列信息以及MEDLINE有关序列的文献信息，并通过相关链接，将他们有机地结合在一起•NCBI还提供了其他数据库，包括在线人类孟德尔遗传(OMIM）、三维蛋白结构的分子模型数据库（MMDB）、人类基因序列集成（UniGene）、人类基因组基因图谱（GMHG）、生物门类（Toxonomy）等数据库引物设计-PrimerPremier5.0PCR扩增和序列测定序列拼接DNAStar：SeqManBLAST-序列比对确定病原ClustalX-序列比对BioEdit-综合序列分析软件MEGA5-系统发生分析MegAlign-相似性分析GeneDoc-序列差异分析、保守性分析常用分子生物学软件