蛋白质交联方法及其应用

蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。这是现代药物研究领域一个崭新的分支。载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。其载体主要有针对肿瘤细胞表面相关抗原的抗体及其片断，肿瘤细胞表面受体的模拟配基。这些载体与药物或毒素分子连接而成的偶合物，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，被誉为“生物导弹”。为了最大限度地保持导向载体和药物弹头的生物活性，同时实现最大的药物载运量，人们不断创新交联剂，改进交联方法，发展了一批新的各具特性的异型双功能交联剂，提高了导向药物的有效性和实用性。随着新的交联试剂和交联方法的出现，使得放射免疫、酶标免疫和导向药物的研究不断深入；而后者的发展又反过来促进蛋白交联技术趋于成熟。目前的交联方法可以将任一个半抗原或细胞毒分子以一定方式与载体交联，获得所需的偶合物。下面分别介绍蛋白质交联中常用的试剂、方法及其应用。一、交联方法一般说来，蛋白分子中可以用于交联的活性基团有游离氨基(如赖氨酸的c—氨基或末端氨基)、游离羧基(如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及末端羧基)、苯基(苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)、酚基(酪氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羟基(丝氨酸或苏氨酸)、咪唑基(组氨酸)、吲哚基(色氨酸)或胍基(精氨酸)等。为了避免蛋白质变性及其生物活性的损失，药物或半抗原等与蛋白的交联应采用具有中等反应活性的试剂，在温和的条件(如接近中性的pH、室温、水溶液中)进行。(一)重氮化法含芳香胺的化合物，可以与亚硝酸反应形成重氮盐，然后直接连接于蛋白质分子中酪氨酸残基上酚羟基的邻位，即得以偶氮键相联的结合物。这种重氮盐也能与组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应：本方法副反应较多，故一般限于人工抗原的制备。(二)戊二醛法同型双功能交联剂戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏碱，将两分子以五碳链的桥连接起来。戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一，可在4~40℃温度范围，pH6.0~8.0的缓冲水溶液中进行，但是缓冲组份中不得含有氨基化合物。以硼氢化钠或氰基硼氢化还原Schiff氏碱可以形成稳定的单键；根据对偶联键的不同要求，还原步骤也可省略。但是，本交联方法易形成相同蛋白间的连接；产物的均二性较差。因此，多用于酶标抗体的制备。(三)过碘酸盐氧化法[1]糖类或含糖基化合物分子中的邻二醇结构可被过碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱：与戊二醛的交联反应相似，过碘酸钠氧化法比较温和，可在常温和中性pH的条件下进行。这是一个两步反应，第一步生成醛基衍生物后，过量的过碘酸盐必须除去或消耗后，方可进行与蛋白交联的第二步反应。(四)混合酸酐法半抗原或药物及其衍生物分子中的羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上的伯氨基反应，形成酰胺交联键：本反应过程简单，毋需制备和分离中间产物。(五)碳二亚胺法碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。在反应时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反应生成一个加成中间产物，再与另一分子上的氨基反应形成酰胺键，实现两者的交联：除戊二醛外，碳二亚胺是常见的另一类交联剂，最早用于药物化学和有机化学领域；脂溶性的二环己基碳二亚胺至今仍被广泛用于多肽合成领域，但其反应必须在有机溶剂中进行，不适用于蛋白质交联。水溶性的1—乙基—3—(3—二甲基氨基丙基)—碳二亚胺(EDC)等的出现，使这一缩合反应成功地用于蛋白质交联中。本交联反应条件温和即使在冷却条件下，也能于中性pH中进行。但是，由于碳二亚胺的缩合反应没有选择性；易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物；先将含羧基的药物或半抗原分子与EDC反应，活化羧基后，再加入蛋白反应物，可以减少蛋白分子交联。(六)活泼酯法[2]含有羧基的半抗原或药物在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，与N—羟基琥珀酰亚胺反应，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物：本法是对碳二亚胺法的改进：由于避免了碳二亚胺对蛋白的直接作用，从而避免了蛋白分子间的交联。活泼酯法在导向药物的研究中得到广泛的应用。(七)多元酸酐法[3]半抗原或药物分子中的羟基或氨基与琥珀酸酐、顺—乌头酸酐等在无水吡啶催化下反应，形成单酯或单酰胺衍生物，引入游离羧基，然后以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联：多元酸酐法可以十分方便地将小分子中的羟基或氨基转变为合游离羟基的衍生物，具有较广的应用范围。但是，与羟基形成的酯健在血浆中不稳定；而与氨基形成的酰胺键又往往不能充分降解；释放游离药物，影响导向药物的效价。有趣的是，药物通过顾—乌头酸与蛋白形成的偶合物，在中性pH介质(如血浆中)稳定，而在酸性pH介质中充分解离，释放活性药物。由此产生的溶酶体内降解性复合物，经细胞内化后，进入溶酶体内，在酸性条件下解离。(八)二异氰酸酯法二异氰酸酯类双功能试剂中的两个异氰酸基分别与两个不同分子上的氨基反应，介以不同碳链长度的桥将两者偶联：这类试剂除了能与氨基反应形成取代脲外，(在pH＞7时为主要反应)，尚能与羟基反应形成氨基甲酸酯衍生物；水溶液中的副反应(如第二个异氰酸酯基水解产生的胺，能与另一异氰酸酯分子连接)，可能通过疏水作用导致蛋白的聚合。(九)偶氮苯甲酸法对氨基苯甲酸重氮化后，与带苯环的半抗原偶联引入羧基，再利用羧基的反应连接于蛋白上：(十)O—羧甲基羟胺法半抗原上的酮基与O—羧甲基羟胺反应，制备羧甲基肟衍生物。引入的羧基再与载体蛋白的氨基反应，形成半抗原—蛋白偶合物：(十一)对-肼基苯甲酸法带酮基的半抗原也可以与对—肼基苯甲酸反应，引入羧基，再按常法与载体蛋白交联；(十二)．叠氮化法[4]羧酸甲酯衍生物经肼解、亚硝化，转变为叠氯化物，再与载体蛋白上的氨基反应：(十三)氯乙酸钠法半抗原的羟基与氯乙酸钠反应，形成羧甲基醚衍生物，再通过羧基与蛋白交联：(十四)亚胺酸酯法双功能试剂亚胺酸酯类如丙双亚胺酸二乙酯双盐酸盐可以与半抗原和载体蛋白的氨基交联，中间介以一个三碳桥：亚氨酸酯类水溶性良好，反应条件温和，与氨基的反应选择性高，这类试剂的最大特点是，可与蛋白分子上的赖氨酸残基广泛反应，而不影响蛋白分子的净电荷改变。具有不同碳链长度的亚氨酸酯可将半抗原间以一定距离与蛋白连接。(十五)卤代硝基苯法双功能试剂二硝基二氟苯或二氟二硝基苯砜分子中的氟原于，由于邻近硝基的活化作用，易和半抗原或载体蛋白上的亲核基团如氨基、羟基、巯基等反应：(十六)Mannich反应法酮、酚类半抗原，可以用Mannich反应引入羧基，然后与常法与蛋白交联；(十七)苯醌法交联过程分两步进行，第—步反应完成后，分离除去过量试剂，再进行第二步反应。(十八)E11man试剂法[5]E11man试剂即5．5’—二硫—2，2’—双硝基苯甲酸(DTNB)，该试剂可以与巯基作用，交联反应分两步进行：本法用于游离巯基的保护和活化，以便与游离巯基的另一蛋白分子进行巯基交换反应。(十九)马来酰亚胺基类活泼酯法马来酰亚胺基结构中的双键比较活泼，可与游离巯基进行选择性加成反应。马来酰亚胺基取代羧酸衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与含氨基的药物或蛋白反应，引入马来酰亚胺基，与另—含有游离巯基的分子通过巯基对双键的加成反应连接起来。这是一组异型双功能交联剂，常用的有N—羟基琥珀酰亚胺基—间—(N—马来酰亚胺基)-苯甲酸酯（SMB），N—羟基琥珀酰亚胺—4—(N—马来酰亚胺基)-苯丁酸酯（SMPB）等。(二十)SPDP试剂法[6]异型双功能交联剂N-羟基琥珀亚胺基-3—(2-吡啶基二硫)—丙酸酯(SPDP)可以通过其分子中的活泼酯组份与氨基反应，也可以通过2—吡啶二硫基团与脂肪硫醇反应.SPDP能够于蛋白分子中引入巯基，然后利用巯基交换反应或巯基加成反应与另一分子交联：这是目前较为常用的一种交联剂，交联反应条件温和，副反应较少，能够定量地于蛋白分子中引入保护的巯基，且能够方便地测定其含量。同类的交联剂尚有N—羟基琥珀酰亚胺—(4—a—甲基—a—(2—吡啶基—二硫代甲基)—苯甲酸酯(SMPT)[7]和N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2—毗啶二硫)—丁酸酯(SPDBt[8])。通过在二硫键的a—位引入位阻性基团如甲基，可以增加交联物中二硫键的稳定性。(二十一)苯丁酸氮芥衍生物法[9]苯丁酸氮芥的N—羟基琥珀酰亚胺基酯或混合酸酐衍生物分子中的活性羧基和氮芥基可以分别与两个蛋白分子中的氨基反应，将两者连接起来：在中性及微碱性pH条件下,氮芥基倾向于与巯基反应，而在较高pH时倾向于与氨基反应。(二十二)卤代乙酰衍生物法卤代乙酸的活泼酯衍生物如N—羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯分子中的活泼酯成分和α—位活泼卤素可以分别与蛋白分子中的巯基及氨基反应，实现两种分子的交联：本交联反应迅速，具有较高选择性，形成的硫醚键在血浆中十分稳定。(二十三)双马来酰亚胺试剂法[10]这类试剂的代表为N,N’—邻苯基双马来酰亚胺，可以连接两个含巯基的分子。这是一类比较温和的交联剂，具有较高的反应选择性，但是易形成同类分子的交联产物。(二十四)三氯三嗪试剂法三氯三嗪分子可以与含羟基的分子反应,剩余的第二个氧原子活性稍低，可为蛋白分子上的氨基取代，实现两分子的交联：必须注意，第一个分子中不能含有氨基及巯基等亲核性较强的基团，否则，易形成自身聚合。二、交联方法的选择及偶合物的设计如上所述，蛋白质交联方法的类型繁多，虽然能够满足各方面的需要，但也增加了使用者选择的困难。评价某一交联方法时，应该考虑以下有关因素：①交联反应的效果，如交联产物组成的均一性;②交联反应的产率;③交联过程对生物活性的影响；④交联操作的简便性；⑤交联产物纯化的难易；⑥交联反应结果的可重复性；⑦偶合物的使用目的。理想的交联方法应该保证结合物得率较高，结合物的组成均一，结合比合适，最大限度地保持生物活性，操作方便，纯化容易；在同样条件下，重复性好。然而，目前还没有一种交联方法能够同时满足上述要求。由此，必须根据结合物的使用目的，权衡不同方法的优缺点来选择合适的交联方法；最好同时使用几种交联方法进行比较，择其优者而用之。在人工抗原的制备中，主要要求制备的人工抗原保持半抗原的结构