HIV耐药性毒株检测方法和应用---共86页PPT资料

HIV耐药性毒株检测方法与应用李敬云军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心HIV颗粒艾滋病：AcquiredImmunodeficiencySyndroms，AIDS获得性免疫缺陷综合征人免疫缺陷病毒HumanImmunodeficiencyVirusHIVHIV的生命周期及药物作用靶位RNADNAHIVNucleus宿主细胞核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)蛋白酶抑制剂(PIs)逆转录酶抗HIV药物研发和应用取得长足进展共6类34种药物6种固定剂量药物合剂2种进入/融合抑制剂1种整合酶抑制剂5种非核苷类逆转录酶抑制剂11种核苷（酸）类逆转录酶抑制剂9种蛋白酶抑制剂HIV的耐药性由于HIV的基因发生突变，导致病毒对药物的敏感性下降是抗病毒治疗失败的主要原因耐药性产生的原因•病毒自身因素—内因•药物的选择压力—外因高复制速率重组高突变率~1substitutionpergenomeperround~7-30crossoverspergenomeperround~10.3x109virionsperdayHIV-1:人类最大遗传变异的病原体体内的HIV是彼此不同的一群病毒,全基因组中只有很少的核苷酸是保守的，是复杂的病毒群体（准种Quasispecies）耐药性产生：药物选择压力—外因在药物选择压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快发生在14至28天内耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。HIV-1耐药突变•病毒对抗逆转录病毒药物产生抗性–病毒酶和底物的结合能力下降(PI,NRTI,NNTI,EI)–磷酸化水平增加-ATP或焦磷酸盐可以介导切除链末端终止子的反应，从而破除链终止作用，并且可以补偿性增强聚合酶的活性•降低病毒复制能力•增加病毒对其他抗逆转录病毒药物的敏感性•改变抗原表位•编码缺陷病毒耐药是怎样发生的？敏感毒株耐药毒株药物抑制了敏感毒株的复制耐药株成为优势毒株药物药物压力时间病毒的动态和耐药性病毒载量和复制速率耐药是怎样发展的？野生毒株占优势耐药毒株出现的早期耐药毒株占优势野生毒株耐药毒株获得耐药病毒的两种途径-直接获得:被耐药病毒感染-药物选择:病毒复制过程中可产生随机突变，由于药物压力不足，导致耐药性突变累积ARTOffRx传播NoART耐药性毒株的出现和传播?原发耐药：从未治疗过的病人的耐药继发耐药：治疗后出现的耐药原发感染后耐药毒株能持续吗？野生型毒株耐药性毒株原发感染毒株6个月后分离的毒株24个月后分离的毒株有些耐药毒株可以持续！野生型毒株耐药性毒株原发感染毒株6个月后分离的毒株24个月后分离的毒株HIV-1耐药病毒的传播•发生率缓慢增加;5-25%•抗逆转录病毒治疗(ART)效果降低•耐药毒株的传播是病毒的复制适应性和获得耐药毒株的概率二个因素的函数•病毒的复制适应性、病毒抑制的程度以及接受治疗病人危险行为的类型是影响耐药毒株传播的重要因素。复制适应性影响耐药毒株的传播•在博茨瓦纳，数学模型研究的结果•即使获得耐药毒株的概率很高，但如果耐药毒株的复制适应性是野生毒株的一半，到2009年，耐药HIV毒株的流行率也达不到WHO提出的15%的警戒线水平•如果耐药毒株的复制适应性与野生毒株相同，到2009年，耐药HIV毒株的传播率将超过警戒限水平很多停止抗病毒治疗的病人，由于没有了药物压力，野生毒株取代耐药毒株获得生长优势，这往往伴随着CD4细胞数的下降而抗病毒治疗失败产生耐药的很多病人，尽管病毒未受到有效抑制，但CD4细胞数仍高于治疗前的水平可能耐药毒株的毒力和致病性比野生型病毒低，即使产生了耐药，维持耐药毒株占优势对病人可能也有好处耐药毒株的复制能力与致病特征？05101520251996-971998-992000-01NRTIanyNNRTIanyPIanyprimarytwoclassesthreeclasses耐药毒株的流行率%ofresistantisolatesSanFrancisco总医院新感染病人中耐药毒株的流行率0102030405060NVPEFVDLVAZTD4TDDI3TCFTCABCTDFAPVATVDRVFPVIDVLPVNFVRTVSQVTPV低度中度高度我国部分地区抗病毒治疗失败病人的耐药谱病毒-宿主-药物因素对HIV-1耐药毒株产生的影响病毒:-病毒复制的水平-病毒复制能力-宿主细胞中的病毒库药物:-对ART治疗的遗传屏障-吸收和排出-组织渗透性-药物活性宿主:-服药依从性-基因多态性：酶的等位基因-CD4&辅助受体的水平促使耐药性病毒株出现的因素病毒载量耐药株出现时间300,0000.130,00013,00010300100301,000服药依从性与耐药性病毒株病毒学失败率(%)0204060801009590-9580-9070-8070服药依从性(%)82.171.466.754.621.7依从性与耐药的关系00.10.20.30.40.50.60.70.80.910102030405060707580859095100AdherenceResistance药物配伍不当—药代显著不同药物配伍024483612时间(小时)药物浓度潜在病毒复制区IC90IC50最后一次用药第一天第二天单药治疗与HIV-1耐药病毒相关的临床因素•耐药病毒的原发感染•药物的遗传屏障不充分•在低浓度药物作用时病毒进行复制:–药物剂量不足–服药依从性介于“好”和“中度”之间–宿主遗传多态性(MDR-1,etc)–间断治疗(STI)耐药性突变的表示方法野毒株的氨基酸＋氨基酸的位置＋突变后的氨基酸K103N一级突变（PrimaryMutation）：自身就可导致病毒对药物的敏感性降低二级突变（SecondaryMutation）：与一级突变结合导致病毒对药物的敏感性降低或提高了一级突变毒株的复制适应性主要耐药性突变举例I54/V/T/L/M对蛋白酶抑制剂的高度耐药性M46I/L对蛋白酶抑制剂的高度耐药性M184V/I对Lamivudine的高度耐药性Q151M对NRTI的中度耐药性K103N/R对NNRTI的高度耐药性V106V/M对NNRTI的高度耐药性G190A对NVP的高度耐药性LNRWYFQ416770560AZTLT(WildType)1(Mutant)219215210KMDKLMKddI6574184VVRddCTD657418469416770219215210d4T75VTMSAMutationSelectedinvitroABC74115YFV219184215210416770653TC184E118VI44DVIClinicalsignificanceunderinvestigationNRTIs导致的逆转录酶基因突变核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）•TAMs突变(Thymidineanalogue-associatedmutations)•TAMs-1:M41L、L210W、T215Y、D67N等•TAMs-2:D67N、K70R、T215F和K219Q•Q151M突变复合体:A62V、S68G、V75I、F77L、F116Y和Q151M等•特点，一是首先大量出现非典型突变，而后逐渐发展为典型耐药突变。二是多个突变的积累才能导致高度耐药性。SALK100181100NVPDLVEFVVV103106108188190YGINAICLHAL103103108181YCI236PC188L190225PH5601MutationNNRTIs导致的逆转录酶基因突变非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）•NVP、DLV和EFV•最常见的突变是Y191C、K103N和G190A等•特点:一是发生早二是遗传屏障低，单一突变就可以导致高度耐药性，并可对同类药物产生广泛的交叉耐药性三是突变很稳定，即使停药以后，血药浓度降低，突变也能够在血液中稳定地存在。KVL19910LIDV202432LLM46I5471IVGA8284905471828490104854718284907177828890VLILFGVD363046N84I46I10RTVSQVNFVAPV4632FIRV544750IV10FIIL84AFTS7773SA77367377MVPrimarySecondaryMVAFTSIVSAVTIIIIIRVMR20323336NDVVM844610LPV/RTV5453202471829063LPFL10PIs导致的蛋白酶基因突变膜蛋白gp41基因区突变与膜融合抑制剂的抗性相关EnfuvirtideDSG36VI37AMV38RQ39TN42DN43HR1RegionHIV耐药性毒株的检测方法HIV耐药性检测方法基因型耐药性检测：检测HIV基因组中与耐药性相关的基因突变表型耐药性检测：检测病毒在药物存在的情况下复制和生长的能力，是药敏试验基因型耐药检测•获得编码HIV逆转录酶和蛋白酶的基因序列•检测和报告这些基因序列中耐药相关的基因突变AAAGACAGTAAAAACAGCLysAspSerLysAsnSerCodonMutationSilentMutation基因型耐药性检测针对特定基因突变针对病毒基因序列杂交法：LiPA等测序法：TruGene等HIV-1基因型检测方法对病毒pol或gag-pol基因进行测序-检测与体内或体外耐药相关的突变双脱氧链末端终止法试剂盒(ABS,VGI)或实验室自建方法“inhouse”寡聚核苷酸点阵杂交(Affymetrix)不能及时检测“新”的突变检测点突变线性探针检测法(LiPA)引物特异性的PCR寡核苷酸连接法(OLA)连接扩增法(LigAmp)HIV基因型耐药性检测（序列测定法inHouse）耐药检测的实验室工作步骤分析前标本处理采集标本标本编号提取核酸核酸扩增序列装配序列编辑耐药确定数据编辑序列测定和质量评价标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80℃保存，避免反复冻融直接测序法的检测流程病人血浆标本HIVRNA病毒cDNAHIVRT和PR基因片段序列测定结果解释RNA提取逆转录PCR扩增特定的解释系统病毒RNA提取（Qiagen公司试剂盒）裂解标本，灭活RNA酶加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合洗两次，去除杂质用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA收集RNA备用优点：操作简便、快速、得率高逆转录RNAcDNA反应体系：10XBuffer1ldNTP0.5l外侧反向引物1lRNaseinhibitor0.25lM-MuLVRT0.25lDEPC水2lRNA模板5l42℃水浴1小时，95℃5分钟灭活RT逆转录RNAcDNA反应体系：10XBuffer1ldNTP0.5l外侧反向引物1lRNaseinhibitor0.25lM-MuLVRT0.25lDEPC水2lRNA模板5l42℃水浴1小时，95℃5分钟灭活RT巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第一轮扩增反应体系：10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l外侧正向引物1l外侧反向引物1lTaq酶0.5l水29.5lcDNA模板10l94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循环巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第二轮扩增反应体系：10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l内侧正向引物1l内侧反向引物1lTaq酶0.5l水29.5l第一轮扩增产物10l94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循环扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳扩增产物纯化QIAquickGelextraction试剂盒核酸序列测定双脱氧链末端终止法:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAG