病毒的特性

1.病毒的特性2.病毒的本质：病毒属于微生物界，其不同于其他微生物的特性包括：（1）病毒一般只含有一种核酸——DNA或RNA，而其他微生物，包括细菌、支原体、立克次氏体和衣原体，则都同时含有两种核酸。（2）病毒通过基因组复制和表达，产生子代病毒的核酸和蛋白质，随后装配成完整的病毒粒子；而其他微生物，则是核酸和许多其他组成成分一起参与生长、增殖过程，并常以二分裂或类似的方式进行。（3）病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并借助宿主细胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸编码的蛋白质，乃至直接利用细胞成分。可以这样认为，病毒的生物合成实质上是病毒遗传信息控制下的细胞生物合成过程。（4）某些RNA病毒（反转录病毒）的RNA经反转录合成互补DNA(cDNA1℃)与细胞基因组整合，并随细胞DNA的复制而增殖，这就是所谓的DNA前病毒。（5）病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，因此对于因干扰微生物的这些代谢过程而影响微生物结构和功能的抗生素，具有明显的抵抗力。病毒的定义：病毒属于最小的生命形态，是只能在宿主细胞内才能复制的微生物。当然这是指自然状态的病毒而言，因在人工实验条件下，人们已经掌握在无细胞（cell-free）系统中复制病毒的技术。2．病毒的起源：是指病毒的来源及其演化关于病毒的起源问题，众说纷纭，归纳起来主要有以下三种假说：（1）认为病毒是原始生物物种的后裔；（2）认为病毒来源于细胞核酸；（3）认为病毒是某些较高级微生物的退行性生命物质3.病毒的形态结构：病毒形态是指电子显微镜下观察到的病毒的大小、形态和结构。一个简单的病毒粒子，实质上只是一团遗传物质（DNA或RNA）和它外围的一层蛋白外壳。这层蛋白外壳就是衣壳，具有保护病毒核酸的作用，同时也是病毒核酸有一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞的工具。衣壳和核酸一起总称为核衣壳。在某些病毒，核衣壳就是病毒粒子。但在结构比较复杂的病毒中，则衣窍外面还有一层（或多层）富含脂质的外膜，即囊膜。某些病毒，如流感病毒，在囊膜和核衣壳之间还有一层病毒特意的内膜蛋白，即M蛋白。囊膜的组成成分主要来自宿主细胞，大多是核衣壳在感染细胞内穿越核膜或在感染细胞表面“出芽”时有细胞获得。病毒的增殖病毒的增殖场所——细胞病毒缺乏自身增至所需的完整酶系统，增殖时必须依靠宿主细胞合成核酸和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成分，这就决定了病毒在细胞内转型寄生的特性。活细胞是病毒增殖的唯一场所，也是病毒生物合成所需的能量和材料的供应者。因此，了解动物细胞的微结构及其功能，特别是其中对病毒增殖具有重要意义的机构，是认识病毒增殖过程和规律的必要前提。除成熟的红细胞外，哺乳动物的细胞都是由胞膜、胞浆和胞核三个部分组成。1.胞膜：是胞浆外缘的薄膜2.胞浆：是位于胞膜之内、胞核之外的复杂胶体3.胞核：位于细胞中央。外围有膜，称为核膜，内有核质。病毒的增殖过程：动物病毒的增殖过程大致分为：吸附与侵入、脱壳、病毒成分的合成以及装配与释放等4个主要阶段。1.吸附与侵入病毒吸附分两部进行。首先，病毒和细胞以静电引力相结合。这种吸附是非特异性的。病毒可以在细胞表面任何部位吸附，不具有任何选择性。非细胞颗粒物质，甚至玻璃或金属器皿表面也都可以吸附病毒。这种吸附是可逆的，单纯的稀释或冲洗以及应用抗病毒血清或高浓度盐类和一定的pH环境，都可以使病毒从吸附物上重新解脱出来。病毒吸附的第二阶段，呈不可逆性结合。此时，病毒蛋白（抗受体）与细胞膜表面特定蛋白（受体）特异性结合。病毒粒子上与细胞受体结合的蛋白质，一般都是病毒表面蛋白。不过，抗受体虽在病毒表面，但不一定参与病毒的高度抗原区。2.脱壳病毒脱壳，包括脱囊膜和脱衣壳两个过程。在囊膜病毒（除痘病毒外），脱囊膜的过程就是上述侵入的过程。在没有囊膜的病毒，则只有脱衣壳的过程。3.病毒成分的合成病毒成分的合成，是在病毒基因指令下，利用细胞生物合成的场所和原材料进行合成的过程4.装配和释放新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染细胞内逐步成熟。所谓成熟，是指核酸进一步被修饰。病毒RNA进入衣壳聚形成完整的病毒粒子，这就是装配。病毒粒子是怎样释放出细胞的呢?一般认为，由于细胞的生物合成被病毒阻断，细胞发生变性及死亡，细胞自身的溶解就将病毒释放出来。某些不产生明显细胞病变的病毒的释放方式，目前还不十分清楚。相反，小RNA病毒合成速度极快，病毒粒子在胞浆内大量积聚，也许在细胞死亡之前，就可胀破细胞，释放病毒。理化学因子对病毒的作用：温度病毒在低温下稳定，在高温下易失活。大多数病毒可在0℃以下温度下良好生存。特别是在干冰温度（–70℃）和液氮温度（–196℃）下更可长期保持其感染性。相反，大多数病毒于55～60℃条件下在几分钟到十几分钟内灭活，100℃可在几秒钟内灭活病毒。热对病毒的灭活作用主要是是病毒的蛋白质变性。电离辐射电离辐射的X射线和y射线都有光子组成，其运动速度与光速相同，它们作用于其它物质后产生次级电子，次级电子再通过直接作用和间接作用，作用于病毒核酸（DNA或RNA）而造成病毒失活。电离辐射的直接作用是物质吸收射线产生的次级电子直接作用于核酸分子，造成核酸分子的电离，共价键断裂；电离辐射的间接作用是射线首先作用于核酸分子周围的水分子，形成自由基（OH·、H·）和自由电子，通过自由基和自由电子间接地作用于DNA分子，使其损伤。电离辐射的生物效应大约一半由直接作用产生，另一半由间接作用所致。紫外线紫外线属电磁波辐射，但非电离辐射，其波长范围为328～210nm，其最大杀病毒作用是265nm。紫外线所释放的能量较低，穿透能力较弱，没有电离辐射的杀病毒力强。核酸吸收紫外线后，会发生其他多种结构形式的变化，如链断裂、分子内或分子间交联，以及核酸和蛋白质的交联。核酸结构的变化，使其不能复制和转录，导致病毒的灭活，但病毒蛋白质的免疫原性仍保持。应当指出，长时间的紫外线照射同样可使病毒蛋白变性而丧失免疫原性。另外，紫外线还是一种常用的病毒诱变剂。超声波超声波是指声源振动频率很高，超过20kHz(千赫兹)的特殊声波。超声波主要以强烈震荡作用呈现其对病毒、其他微生物以及细胞的杀灭或破坏作用化学因子：(一)化学灭活:1.酶类2.pH3.脂溶剂4.甲醛和戊二醛5.烷化剂6.蛋白变性剂7.醇类8.染料及其光动力作用（二）保护剂1.甘油：甘油是众所周知且被广泛应用的保护剂。在50％甘油盐水中，大多数细菌被杀灭但病毒却可以存活达几十天、几个月甚至几年（决定于病毒的种类）。病毒学实践中常用50％甘油盐水保存含病毒材料，同时采取冷藏措施，效果比较理想。但是必须指出，少数病毒（例如牛瘟病毒）并不能在甘油盐水中长期存活。2.二甲基亚砜（DMSO)：二甲基亚砜（DMSO)可减少冷冻过程中微小冰晶的形成，因而对冻存的病毒有保护作用3.病毒冻干用保护剂：常用的有明胶、血清、胨、白蛋白、谷氨酸钠、脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮等，这些物质对病毒的保护作用是多方面的，如5％～10％的糖类和5％谷氨酸钠等低分子物质使干燥样品中的水分含量不致过低，可防止蛋白质的变性，高分子物质如血清、明胶、白蛋白等能促进病毒制品在冻干过程中的升华干燥，当冻干的病毒加水复原时，还能够提高溶解性病毒的保存病毒的短期保存：可直接或悬浮于50％甘油盐水中，置–30℃冰箱中保存病毒的长期保存：1.快速低温冰冻：在病毒悬液内加入灭活的动物血清或其他蛋白质保护剂，最好加一些二甲基亚砜（例如5％～10％），并迅速冷冻和保存于–70℃或–196℃。含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；如先浸入50％甘油盐水中，再进行低温保存，效果更好。2.冷冻干燥：是在真空条件下使冰冻的悬液脱水。常用的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶等。冷冻干燥毒种时，一般应用脱脂牛乳、灭活的正常动物血清、饱和蔗糖溶液等作为保护剂。真空干燥时，将病毒悬液与5℃10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2～0.5ml,立即放进真空干燥机内进行冷冻干燥。这样的冻干毒种一般可在4℃冰箱内保存几年到十几年。病毒感染对细胞的损害：1.细胞死亡：病毒引起的细胞死亡，原因比较复杂，既有病毒粒子或病毒物质的直接的理化学障碍或毒性作用，又有细胞发生病变后的自身性继发作用。2.包涵体：细胞在感染病毒以后，出现于细胞浆和细胞核内的特殊结构，称为包涵体。3.细胞融合：细胞在病变过程中出现多核细胞的现象，就是细胞融合。4.红细胞凝集5.细胞转化：（是形成肿瘤的基础，但并不必然形成肿瘤）6.感染动物体内的细胞损伤病毒病的免疫预防：应用疫苗进行免疫接种是疾病防控的主要手段之一。决定疫苗免疫效果的关键因素是疫苗本身的质量。目前普遍应用的病毒疫苗主要分为弱毒（活）疫苗和灭活疫苗两类。近年来随着分子病毒学研究的不断深入，相继研制出了亚单位疫苗、基因疫苗、活载体疫苗和分子疫苗等，有些取得了好的免疫效果弱毒（活）疫苗：1.自然株疫苗2.人工合成株疫苗灭活疫苗新型可复制性疫苗：1.基因缺失型弱毒疫苗2.插入突变株疫苗3.病毒载体活疫苗新型非复制型疫苗：1.抗独特性抗体疫苗2.亚单位疫苗3.合成肽疫苗DNA疫苗被动免疫（免疫血清或免疫血清中提取的免疫球蛋白）细胞及病毒的培养一．实验动物：实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。但后来发现，实验动物经常自身带有病毒，常常混淆实验结果，并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险，为了克服这个缺陷，目前已经通过微生物控制手段，培育出无菌动物（GF）、已知菌动物或称悉生动物（GN）和无特定病源动物（SPF）。实验动物主要用于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒；②培养病毒，制造抗原和疫苗；③测定各毒株之间的抗原关系，例如应用实验动物作中和实验和交叉保护试验;④制备免疫血清和单克隆抗体；⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定，建立病毒病动物模型等。二．鸡胚：鸡胚（包括其它禽胚）是在发育中的机体，多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代，并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。鸡胚的接种方法有：绒毛尿囊膜接种、尿囊腔、卵黄囊和羊腔膜等四种接种方法。1.绒毛尿囊膜接种：主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。一般用10～12日龄的鸡胚。2.尿囊腔接种：主要用于正粘病毒和副粘病毒。如禽流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖，也是制备马脑炎病毒疫苗的常用接种途径。一般用10～11日龄的鸡胚。3.卵黄囊接种：主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。一般用6～8日龄的鸡胚。4.羊膜腔接种：主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。在由病料初次分离病毒时，羊腔膜接种法比尿囊腔接种法敏感。但此法操作技术比较困难，鸡胚也容易受伤致死。选用11～12日龄的鸡胚，按容貌尿囊魔界重法造成人工气室，撕去卵壳，并刺破绒毛尿囊膜血管较少的部位，用钝端镊子沿此破孔插入，夹起羊膜囊，注入0.1～0.2ml接种物。由于不易判断接种物是否被正确地注入羊腔膜内，故可将已经吸取了接种物的注射器的筒栓稍微回抽，使注射针芯内含一个气泡，注射时将气泡和接种物一起注入。将卵适当倒转，即可清楚地看到气泡是否在羊腔膜内，以判定注射是否正确。（三）组织培养（一）器材准备1.玻璃器材：组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用耐酸、耐热、透明度强而且表面应平坦光滑的中性硬质玻璃，更应注意质量，以利于细胞贴壁增殖和观察。新购的玻璃器皿，在清除污物和晾干后，浸泡于硫酸—重铬酸钾洗液内24小时以上，然后捞出，用清水冲洗后，在用放有优质的洗衣粉或洗洁精的溶液洗刷干净，并用清水和纯化水分别冲洗5～6遍，再浸泡在注射用水中24小时以上，然后捞出，并用去离子水冲洗3～4遍以后，晾干或烘干，等待包扎和灭菌。带毒的玻璃器皿需先浸泡于5％来苏液或1％盐酸溶液（以病毒种类而定）中