血浆游离DNA(ctDNA)提取标准操作规程

1血浆游离DNA提取标准操作规程1.目的：制定DNA提取标准操作规程，使尽可能多提取到血浆游离DNA。2.适用范围：血浆提取。3.术语及定义：无。4.职责：4.1文件编写：高通量实验室技术员。4.2文件审核：高通量实验室组长。4.3文件审批：实验室主任。4.4执行：高通量实验室的所有工作人员。5.操作规程：5.1准备工作5.1.1紫外杀菌：打开超净工作台内的紫外灯，杀菌30min，关闭紫外灯，打开抽风机，通风10min。5.1.2实验前准备：通风结束后，根据《实验室安全防护规程》中的相关规定，换好洁净服、洁净帽、防护镜等进入实验室；将恒温金属浴打开至56℃，将恒温水浴锅打开至60℃。5.1.3准备物品：准备1.5mL及2.0mL的EP管，50mL离心管，96孔双面板，1000μL、200μL、100μL、20μL、和10μL移液枪和枪头，游离核酸提取试剂盒（离心柱法）。5.1.4试剂准备及配制：5.1.4.1无水乙醇，异丙醇。5.1.4.2每管CarrierRNA（干粉）中各加入1550μL的洗脱液（AVE），充分混匀，溶解。-20℃保存（CarrierRNA为白色或半透明物质，请确保其完全溶解；反复冻融不可超过三次，可分装保存避免反复冻融）。5.1.4.3每瓶AW1加入25mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。5.1.4.4每瓶AW2加入30mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。5.1.4.5每瓶ACB加入200mL的异丙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。5.1.4.6BufferAL与CarrierRNA进行混合，配制成裂解工作液(现配现用)1人份12人份24人份2BufferAL0.9mL10.6mL21.1mLCarrierRNA5.6μL67.5μL135μL5.1.5真空泵准备依次将LuerslotoftheQIAvac24Plus(closedwithluerplug)、开关阀、连接器、吸附柱、扩展管装到真空泵底座上（装紧以防止漏气）。5.2DNA提取流程5.2.1在50mL的离心管内加入100μL的蛋白酶K。5.2.2取1.0mL样本加入离心管中。5.2.3再加入800μL的裂解工作液，震荡30秒，瞬时离心。60℃恒温水浴锅温育30分钟。5.2.4加入1.8mLACB，震荡15秒，瞬时离心，冰上孵育5分钟。5.2.5将混合液全部转移至吸附柱，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0，小心移去扩展管。5.2.6加入600μL的抑制物去除液(ACW1)，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0。5.2.7加入750μL的去离子液(ACW2)，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0。5.2.8加入750μL的无水乙醇，打开真空泵，液体全部流过吸附柱后，关闭真空泵，等压力降至0，盖紧管盖。5.2.9将吸附柱取出，放置于2.0mLEP管于室温下14000rpm（最大转速）离心3分钟。5.2.10将吸附柱取出，放置于新的2.0mLEP管。打开管盖，56℃放置2分钟。5.2.11将吸附柱取出，放置于新的1.5mLEP管，在吸附柱膜的正上方小心加入50μL洗脱液（AVE），盖紧管盖，室温静置3分钟，14000rpm离心1分钟。5.2.12EP管内即为提取后的核酸，可立即使用或置于-20±5℃待用。5.3样本的质控标准提取好的DNA样本，使用Qubit3.0荧光计检测其浓度，浓度在2ng/μL以上为合格，可用于后续的文库构建，若DNA浓度小于2ng/μL，则需重新进行DNA的提取。6.注意事项：6.1实验步骤较多，每一步实验开始前都要做好准备工作，每一步实验结束后先清理前面的试剂耗材，再进行下一步操作。36.2实验过程中除使用仪器时在超净台外工作，其它一切工作都要在超净台中操作；6.3处理过程中产生的垃圾必须扔到专用的黄色医疗垃圾袋中，黄色医疗垃圾袋必须扔到首二层垃圾房的黄色垃圾桶中；6.4所有离心步骤均在室温下进行，15-25℃；6.5实验完毕用10%次氯酸或75%酒精处理工作台和移液枪，然后用紫外线灯照射20-30分钟。7.紧急状况处理：实验过程中出现任何预期之外的情况，应及时上报给主管人员，并做好相关记录，不可隐瞒不报。