分子病理学技术

分子病理学技术及其应用南京大学医学院附属鼓楼医院病理科王景美分子病理学定义由分子生物学、医学遗传学和病理学相结合所形成的交叉学科。研究基于体细胞基因突变及其产物异常的疾病，研究它们的发生和发展机制。应用分子生物学和分子遗传学的原则、理论和技术来确诊遗传性疾病、发育异常性疾病、感染性疾病和恶性肿瘤，从而阐明这些疾病的自然史，并为临床医生提供与治疗有关的信息。借用遗传学、基因组学和蛋白质组学所创建的方法，在DNA、RNA和蛋白质三个层次来实现。传统病理学分子病理学研究内容组织形态学遗传学、基因组学及蛋白质组学研究对象目标病灶或细胞(群)DNA,RNA,Protein研究手段形态学观察分子生物学及医学遗传学技术优点“金标准”高敏感性、高特异性，定性，定量缺点主观判断要求较高，影响因素多分子病理学与传统病理学的区别J.Gu:Three-andfour-dimensionalimagesofmorphologyandpathology.CellVision.6:357-469,1997分子病理学的发展1990年人类基因组计划的成功实施使得医学进入了分子时代。上世纪九十年代，分子生物学理论和方法引进病理学，形成了分子病理学。近年来，FISH、感染原的PCR诊断、基因重排等分子诊断技术，已从实验室研究走向临床实际医疗工作。国内尚处于起步阶段。分子病理学常用技术PCR及原位PCR技术原位杂交(ISH)及荧光原位杂交(FISH)限制性核酸内切酶片断长度多态性分析(RFLP)基因突变分析和核酸序列分析生物芯片PCR基因诊断技术核酸化学---组成与结构核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，分核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两种DNA主要存在于细胞核染色质中，携带遗传信息；RNA主要存在于细胞质中(90%)，参与细胞内遗传信息的表达构成核苷酸的碱基主要有五种：A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。DNA为一反向平行的互补双链结构，碱基互补配对（A=T,GC)核酸化学---理化性质一般理化性质变性：DNA分子中的两条链分开形成单链的过程复性：分开的单链分子按照碱基互补原则重新形成双链的过程中心法则---决定生命的法则DNA是自身复制的模板DNA通过转录作用将遗传信息传递给中间物质RNARNA通过翻译作用将遗传信息表达成蛋白质DNA双螺旋结构示意图PCR技术原理及特点PCR基本原理是一种选择性体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异性DNA序列反应分为三步：（1）变性(denature):通过加热使DNA双链解离形成单链（2）退火(anneal):突然降低温度使引物和互补的模板杂交（3）延伸(extension):以引物为起始点的DNA链延伸反应一个变性－退火－延伸的过程就是一个循环PCR原理示意图PCR技术的发明及发展1985年Mullis教授发明了PCR技术PCR技术首先应用于人-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断PCR技术在短短几年内广泛应用于分子生物学、微生物学、遗传学等生物学的各个领域1988年PCR技术在我国开展PCR技术的特点敏感性高特异性强快速、简便可扩增RNA或cDNA存在的一些问题几种常用PCR技术类型二温式PCR逆转录PCR（RT-PCR)巢式或套式PCR（NestedPCR)多重PCR（Multiplex-PCR)定量PCR不对称PCR（asymmetricPCR)其它PCR技术主要仪器设备o离心机oPCR仪o电泳装置o紫外分光光度计o其他：超纯水制造系统、计量仪器、通风设备热循环扩增加样(灭菌水、10PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶）操作程序制备DNA标本电泳、观察标本的来源及取样组织标本：新鲜组织标本或冰冻组织、石蜡包埋组织、脱落细胞体液及排泄物：全血、血清、唾液、尿液、胸水、腹水、羊水、生殖道分泌物等细菌培养物DNA模板的制备DNA沉淀组织处理破碎细胞，消化蛋白质（EDTA、SDS等去污剂/加热/碱等的作用＋蛋白酶K）DNA纯化（除去蛋白质、多糖及脂类等生物大分子）酚－氯仿提取法加热法碱变性法表面活性剂裂解法常用DNA模板制备方法PCR扩增体系的基本成分引物TaqDNA聚合酶10PCR缓冲液MgCl24dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)模板DNA其他PCR条件的优化引物Mg2＋温度循环参数其他PCR扩增产物的分析琼脂糖凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法注意事项预防污染：隔离不同操作区、分装试剂、改进实验操作、结果的重复性污染源的追踪：设立阳性及阴性对照、选择合适引物、环境污染污染的处理：稀酸处理法、UV照射法PCR技术的临床应用病原体检测遗传性疾病的基因诊断肿瘤基因的检测PCR技术检测病原体病毒检测：肝炎病毒、HIV、HPV、HSV、CMV等细菌检测：肠道致病菌、呼吸道致病菌、脑膜炎双球菌、林球菌等其他病原体：寄生虫、衣原体、支原体、梅毒螺旋体等PCR技术在遗传性疾病诊断中的应用地中海性贫血（珠蛋白基因突变或缺失/珠蛋白基因突变）镰状细胞性贫血（珠蛋白基因突变）苯丙酮尿症血友病其他：视网膜色素变性、先天性肾上腺皮质增生PCR技术检测肿瘤基因基因重排癌基因检测：Ras,C-myc,CerbB2抑癌基因检测:p53,APC,BRCA基因重排原理正常造血细胞向B或T淋巴系定向分化时，发生特异性Ig和(或)TCRs基因重新组合，使结构上分散排列在DNA上的V、D、J基因片段发生重排，形成了免疫球蛋白和T细胞受体复杂和多样性的功能基因，经PCR扩增后产生多个基因片段，电泳呈弥漫涂片状。发生肿瘤时，淋巴细胞的增殖是克隆性的，免疫球蛋白和T细胞受体基因重排的功能受抑。经PCR扩增后产生单一(单克隆性)基因条带基因重排原理示意图引物、引物配制及产物IgH引物：FR3A、LJH、VLJH(半巢式PCR扩增，最终产物80～120bp左右的条带)TCR混合引物：V区引物I(mix1)：V2、V3、V4、V8、V9V区引物II(mix2)：V5、V10、V11、V12J区引物(mix3)：JGT12、JGT3、JGT4(mix1+mix3及mix2+mix3分别扩增，最终产物170～230bp左右的条带)引物浓度：20pmoles/LPCR方法反应体系25l(模板DNA5l,10PCR缓冲液2.5l，10mMdNTP0.5l,25mMMgCl21.5~4l,上下游引物各20pmoles,Taq酶0.625U,灭菌双蒸水补足至25l)PCR循环程序：94˚C5min94˚C1min72˚C1min72˚C10min(35个循环)55˚C1min阳性结果判定标准带宽不超过1mm，边缘整齐条带在期望的碱基大小范围之内如背景上无smear，又无引物二聚体则表示PCR扩增的失败，而非阴性结果如出现期望大小之外的其他条带，均应视为人工假相，不能作为判定依据IgH基因重排出现在B-NHL约为75%，在T-NHL占10%~20%。几乎所有的T细胞肿瘤和约40%~69%的B细胞肿瘤均有TCR基因重排IgH、TCR基因重排在NHL、反应性淋巴细胞增生性淋巴结炎及恶性组织细胞病的鉴别诊断中具有重要意义克隆性IgH、TCR基因重排的检测，对NHL、ALL、MM和CLL等淋巴细胞来源肿瘤的诊断和鉴别诊断，对NHL的早期骨髓浸润和预后判断具有重要意义