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具体的操作步骤是，RNA提取，随机引物反转录，反转录产物10倍稀释，real-timePCR.这个是标准的两步法。一步法是把反转录和扩增联合起来做，不推荐使用。具体的注意事项有1：高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-timePCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。2：减少加样误差，在使用SYBRGreenMIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，为什么要使用5微升，是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。3。选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。4。合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等等Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1mlTrizol(invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1mlTrizol(Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)3)4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀)，室温静置10min;5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清;6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNaseІ(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。RNADNaseІ10xbufferH2O(RNasefree)RNasin30201039.50.5µlµlµlµlµl总体积100µl然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min;4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清;5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干;6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1)纯度检测：取1μlRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA，18srRNA和28srRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1.mRNA：1)在RNasefree的PCR管中配置下列溶液.2)将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性;3)在该PCR管中加入下列试剂(Promega)oligo（dT）Randomprimer10mMdNTPRNaseinhibitor5xbufferM-MLV0.50.52.00.54.00.5µlµlµlµlµlµl总体积8.0µl4)将上述20μl反应溶液30℃保温10min;5)42℃保温50min;6)85℃保温10min;7)-20℃保存。2.microRNA：使用茎环逆转录法，原理如下图：1)在去RNase的PCR管中配置以下溶液.TotalRNAH2O1.0µgµl总体积12µltotalRNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*Xµgµl2)将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构;3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mMdNTP(promega)RNaseinhibitor(promega)U6逆转录引物5xbufferM-MLV(promega)2.00.50.54.00.5µlµlµlµlµl总体积7.5µl4)将3)溶液加入到1)溶液中，混匀后30℃保温10min;5)42℃孵育50min;6)85℃孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1.引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2.确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。(1)一个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3.正式实验：体系配制：H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul(TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul(10uM)下游引物0.5ul(10uM)总体积15ul总体积12.5µl计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份--1份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。3.cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)4.把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五.上机：5.1先开电脑，进入Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开7500软件，选择“新建”，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”(普通基因检测为“60”，MicroRNA检测为“65”)5.3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。5.4点击File菜单中Save，输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5点击Start键，开始运行程序。5.6程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭ABIPRISM7500SDS软件、PCR仪电源开关。5.7在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。(同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃)