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-1-附件2：辅助改善记忆功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1试验项目1.1动物实验1.1.1体重1.1.2被动行为试验：跳台实验，避暗实验1.1.3主动行为试验：穿梭箱实验，水迷宫实验，Morris水迷宫实验1.2人体试食试验1.2.1指向记忆1.2.2联想学习1.2.3图象自由回忆1.2.4无意义图形再认1.2.5人像特点联系回忆1.2.6记忆商2试验原则2.1动物实验和人体试食试验为必做项目。2.2动物实验强调被动行为试验和主动行为试验的组合，以保证实验结果的可靠性。2.3动物实验至少应选择三项实验，并且在被动行为试验、主动行为试验中至少要各选一项实验。2.4正常动物与记忆障碍模型动物任选其一。2.5动物实验应重复一次（重新饲养动物，重复所做实验）。2.6人体试食试验统一使用临床记忆量表。2.7在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3结果判定3.1动物实验：被动行为试验(跳台实验、避暗实验)二项实验中任一项实验结果阳性，主动行为试验（穿梭箱、水迷宫、Morris水迷宫实验）三项实验中任一项实验结果阳性，且重复实验结果一致（所重复的同一项实验两次结果均为阳性），可以判定该受试样品有助于改善记忆功能动物实验阳性。3.2人体试食试验：记忆商结果阳性，可判定该受试样品具有改善记忆的作用。-2-有助于改善记忆功能检验方法MethodfortheAssessmentofAssistingMemoryImprovementFunction1动物实验1.1被动行为试验：跳台实验1.1.1原理反应箱底铺有通36v电的铜栅，动物受到电击，其正常反应是跳上箱内绝缘的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台，如此训练5min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数，以此作为学习成绩。24h或48h重作测验，此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。停止训练5天后（也可以在训练后的一周、两周或其它时间点）进行记忆消退实验。1.1.2仪器与试剂跳台仪：该装置为10×10×60cm3的被动回避条件反射箱，用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅，间距为0.5cm，可以通电，电压和电流强度由一变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5cm的绝缘平台。最好采用附带隔音箱和视频分析系统的仪器。试剂：樟柳碱、环已酰亚胺、乙醇。1.1.3实验方法1.1.3.1实验动物推荐使用近交系小鼠。断乳鼠或成年鼠（18－22g）。用于改善老年人记忆的产品必须采用成年鼠。雌雄均可，单一性别，每组10-15只。1.1.3.2剂量设计和分组实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍作为其中一个剂量组，另设两个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.1.3.3实验步骤1.1.3.3.1受试样品对正常小鼠记忆的影响末次给样后次日（或一次给样后1h）开始训练。将动物放入反应箱内（台上、台下）适应环境3min，然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通以36v（或0.3-0.4mA）的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台（绝缘体），以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5min内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩。24或48h后进行重测验，将小鼠放在平台上，记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各鼠3min内电击次数和受电击的动物数总数，同时计算出现错误反应的动物的百分率（受电-3-击的动物数占该组动物总数的百分率）。以上实验步骤为记忆获得过程。停止训练5天后（包括第5天）可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验（即记忆再现过程，方法同重测验）。1.1.3.3.2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响1.1.3.3.21模型制造记忆获得障碍模型制造：训练前10min腹腔注射樟柳碱或东莨菪碱5mg/kgBW；记忆巩固障碍模型制造：训练前10min腹腔注射环已酰亚胺120mg/kgBW；记忆再现障碍模型制造：重测验前30min灌胃30％的乙醇10mL/kgBW。1.1.3.3.2.2记忆测试的操作方法：同1.1.3.3.1。1.1.4数据处理及结果判定潜伏期和错误次数结果均为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。跳下平台的动物数为计数资料，可用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。若受试样品组与对照组比较，潜伏期明显延长，错误次数或跳下平台的动物数明显少于对照组，且差异有显著性，可判定为该项指标阳性。以上三项指标中，任一阶段（记忆获得和记忆再现）的任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。1.1.5注意事项1.1.5.1动物在24h内有其活动周期，不同时相处于不同的觉醒水平，故每次实验应选择同一时相（上午8－12点或下午1－4点）。1.1.5.2实验应在隔音,光强度和温、湿度适宜且保持一致的行为实验室进行。1.1.5.3推荐使用纯系动物，实验前数天将动物移至实验室以适应周围环境。1.1.5.4实验者必须每天与动物接触，如：喂水、喂食和抚摸动物。1.1.5.5减少非特异性干扰，如：情绪、注意、动机、觉醒、运动活动水平、应激和内分泌等因素。1.1.5.6考虑动物种属差异。1.1.5.7实验中应及时清除铜栅上的粪便等杂物，以免影响刺激鼠的电流强度。1.2被动行为试验--避暗实验1.2.1原理利用小鼠嗜暗的习性设计一个装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅，并与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间。小鼠进入暗室即受到电击，计时自动停止。1.2.2仪器和试剂避暗仪：该装置分明暗两室。明室大小为12cm×4.5cm，其上方约20cm处-4-悬一40w钨灯丝。暗室较大，大小为17cm×4.5cm，两室之间有一直径约3cm的圆洞。两室底部均铺以铜栅。暗室底部中间位置的铜栅可以通电，电击强度可在一旋钮上任意选择。一般采用40v电压（或0.3-0.4mA电流）。暗室与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间。最好采用附带隔音箱和视频分析系统的仪器试剂：樟柳碱、环己酰亚胺、乙醇。1.2.3实验方法1.2.3.1实验动物同1.1.3.11.2.3.2剂量设计和分组同1.1.3.21.2.3.3实验步骤1.2.3.3.1受试样品对正常小鼠记忆的影响末次给样后次日（或一次给样后1h）开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，取出小鼠，记录每鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间，此即潜伏期，训练5min，并记录5min内电击次数。24h或48h后重作测验，记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数，并计算5min内进入暗室（错误反应）的动物百分率。以上实验步骤为记忆获得过程。停止训练5天后可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验（即记忆再现过程）。1.2.3.3.2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响:1.2.3.3.2.1模型制造：方法同1.1.3.3.2.11.2.3.3.2.2操作方法：同1.2.3.3.11.2.4数据处理及结果判定潜伏期时间和5min内进入暗室的次数均为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。5min内进入暗室的动物数为计数资料，可用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。若受试样品组小鼠进入暗室的潜伏期明显长于对照组，5min内进入暗室的错误次数或5min内进入暗室的动物数少于对照组，且差异有显著性，可判定为该项指标阳性。以上三项指标中任一阶段（记忆获得和记忆再现）的任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。1.2.5注意事项：同1.1.51.3主动行为试验--穿梭箱实验1.3.1原理：以光(或声)、电击为联合刺激，使实验动物由被动回避建立主动的条件反射。记录此条件反射建立过程中的主动回避反应指标可反应实验动物的学习、记忆能力的变化。-5-1.3.2仪器与试剂仪器：大鼠穿梭箱。穿梭箱由实验箱和自动记录打印装置组成。实验箱大小为50cm×l6cm×l8cm。箱底部格栅为可以通电的不锈钢棒，箱底中央部有一高1.2cm挡板，将箱底部分隔成左右两侧，即安全区和电击区。实验箱顶部有光源或(和)蜂鸣音控制器，自动记录打印装置可连续自动记录动物对电刺激[灯光和(或)蜂鸣器]的反应和潜伏期，并将结果打印出来。最好采用附带隔音箱和视频分析系统的仪器。试剂：樟柳碱，环已酰亚胺，乙醇1.3.3实验方法1.3.3.1实验动物Wistar或SD大鼠，断乳鼠或成年鼠，雄、雌均可。1.3.3.2剂量设计和分组同1.1.3.2。1.3.3.3实验步骤1.3.3.3.1受试样品对正常大鼠条件反射建立的影响将大鼠放入箱内任何一侧，20s后开始呈现灯光或蜂鸣音，持续20s，后10s内同时给予电刺激（100V，0.2mA，50Hz，AC)。大鼠在遭电击后即逃避，必须跑到对侧顶端，挡住光电管后才可中断电击，此为被动回避反应，在每次电击前给予条件刺激，反复强化后，大鼠在接受条件刺激后即跳向对侧并挡住光电管而逃避电击，此为主动回避反应，每隔天训练一回，每回50次，连续训练4-5回后，动物的主动回避反应率可达80-90%以上。根据打印结果分析如下指标：动物反应次数，动物主动回避时间，动物被动回避时间，动物主动回避率。以上实验步骤为记忆获得过程。停止训练5-50天内，分2-3次测定其记忆消退情况（即记忆再现过程）。1.3.3.3.2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响1.3.3.3.21模型制造：同1.1.3.3.2.11.3.3.3.2.2操作方法：同1.3.3.3.1。1.3.4数据处理及结果判定动物主动回避时间和被动回避时间为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。动物主动回避率为计数资料，可用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。若实验组主动和/或被动回避时间明显短于对照组，或主动回避率低于对照组，且差异有显著性，可判定为该项指标阳性。以上三项指标中任一阶段（记忆获得和记忆再现）的任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。1.3.5注意事项同1.1.5。1.4主动行为试验--水迷宫实验-6-1.4.1原理动物都有一种“探索”和“更替”倾向，当离开一个臂时，总是跑向“久”未跑过的“新”臂。小鼠不愿在水中，因而寻找能爬出水面的阶梯，训练后，小鼠能记住找到阶梯的路线。1.4.2仪器与试剂水迷宫自动记录仪。该仪器是由迷