培养基的配制

1、了解培养基的概念、种类和用途，明确培养基的配制原理。2、学习掌握培养基配制的一般方法和步骤。3、掌握高压蒸汽灭菌的方法步骤。实验目的培养基的配制培养基(culturemedium)是指人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多，不同种类的培养基一般都应含有微生物生长所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大营养要素，且各成分比例应合适。为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基合适的pH。实验原理牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCL提供无机盐。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。常用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基广泛用于细菌的培养；高氏一号培养基用于培养放线菌；马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养霉菌。常用凝固剂是琼脂，固体培养基琼脂加量通常为1.5%-2%；半固体培养基琼脂加量为0.5%-0.8%。实验分组安排4-5人一组配制牛肉膏蛋白胨固体培养基400mL马铃薯糖琼脂培养基200mL淀粉琼脂培养基（高氏培养基）200mL平皿30个99mL无菌水装三角瓶6瓶9mL无菌水试管装12支1mL吸管15支牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面5支牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g水1000mlpH7.4-7.6淀粉琼脂培养基（高氏培养基）：可溶性淀粉20g硝酸钾1g磷酸氢二钾0.5gNaCl0.5g硫酸镁0.5g硫酸亚铁0.01克琼脂15-20g水1000mlpH7.2-7.4马铃薯蔗糖琼脂培养基：把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入15克琼脂，煮沸溶解后加蔗糖20克补足水分pH值调到7.2～7.41、称量及溶化2、调pH3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）4、分装、加塞、包扎5、灭菌6、摆斜面操作步骤称量与溶化：注意：1）牛肉膏的称取：用玻璃棒蘸取适量牛肉膏，抹于称量纸上，勿取过量，不足时，再蘸取少量，逐步添加；然后将牛肉膏连同称量纸放入水中，稍等片刻牛肉膏即从称量纸上脱落，用玻璃棒将纸捞出即可。操作步骤(continued)称量与溶化：注意：2）蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品．瓶盖也不要盖错。操作步骤(continued)调pH值：在未调pH值前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达要求。反之，用1mol/LHCl进行调节。操作步骤(continued)加琼脂、溶化、定容、（过滤）琼脂一般应在调好了pH后加入，琼脂的加入不会影响培养基的pH。琼脂加入后应煮沸数分钟，以使其完全溶化，否则易出现分布不均，导致部分斜面不凝固或过软，另外部分则琼脂过多。加热过程中因水分蒸发而可能使培养基体积减小，应补充水分至所需量。操作步骤(continued)分装：1）装量：液体——试管高度的1/4左右固体——试管高度的1/5，灭菌后摆斜面半固体——一般为试管高度的1/3，灭菌后垂直放置操作步骤(continued)棉塞制作方法：加塞：棉塞或硅胶塞作用：防止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。包扎：◇加塞后，试管通常每7支一起，包上一层牛皮纸或两层报纸，用线绳扎紧。三角瓶加塞后也用牛皮纸包扎。◇以活结形式扎紧，以便使用时容易解开。◇用记号笔注明培养基名称、配制日期、配制人或实验组。操作步骤(continued)灭菌时包牛皮纸灭菌：◇培养基灭菌一般采用压力蒸汽灭菌◇通常灭菌条件为1.05kg/cm2,121℃灭菌20分钟；含糖量高的培养基，则为0.56kg/cm2,115℃灭菌30分钟。操作步骤(continued)摆斜面：◇成扎摆放，不需将每支试管单独摆放◇最好待培养基冷至60℃时摆斜面，以免形成大量冷凝水无菌检查：将灭菌的培养基放在37℃温箱中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。二消毒与灭菌加热法干热法湿热法火焰烧灼热空气灭菌压力蒸汽灭菌间歇灭菌煮沸灭菌巴斯德消毒实验原理1、了解掌握常用消毒、灭菌方法的原理。2、学习掌握干热灭菌和压力蒸汽灭菌操作步骤。实验目的滤膜过滤器的滤膜是一种多孔纤维素，孔径一般为0.45um，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截流在滤膜上。过滤除菌——许多材料，如血清、糖溶液等，用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，应采用过滤除菌。应用最广的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。紫外线灭菌——紫外线波长在200-300nm,具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。实验原理(continued)干热灭菌电烤箱实验内容及实验步骤1、干热灭菌2、压力蒸汽灭菌干热灭菌1、装入待灭菌物品2、升温接通电源，加热升温至160-170℃。3、恒温保持160-170℃2小时。4、降温切断电源，自然降温。5、开箱取物待烤箱温度降到70℃以下以后，方可打开箱门，取出物品。箱内温度高于70℃，切勿自行打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。实验内容及实验步骤(continued)实验内容及实验步骤(continued)压力蒸汽灭菌压力蒸汽灭菌1、检查水位，放入物品。2、加盖、拧紧对称用力3、加热升温4、排冷空气等压力升至0.5kg/cm2时，打开排气阀，排净冷空气。5、升温、保压等锅内压力升至所需数值（通常为1.03kg/cm2），保持压力20-30分钟。6、降压、取物实验内容及实验步骤(continued)