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SampletoInsight2013年11月QuantiNova®SYBR®GreenPCR用户手册使用SYBRGreen实现高灵敏度、超快速的实时定量PCR以及两步法RT-PCR2QuantiNovaSYBRGreenPCR用户手册03/2016产品包装清单QuantiNovaSYBRGreenPCRKit货号反应次数(20μl/10μl)(100)208052100/200(500)208054500/1000(2500)2080562500/50002xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix包含：•QuantiNovaDNAPolymerase（包括TaqDNAPolymerase、QuantiNovaAntibody和QuantiNovaGuard)•QuantiNovaSYBRGreenPCRBuffer•dNTPmix(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)1ml3x1.7ml15x1.7mlQuantiNovaYellowTemplateDilutionBuffer500μl500μl5x500μlQNROXReferenceDye250μl1ml5x1mlRNase-Free水1.9ml1.9ml5x1.9ml快速入门指南111存储QuantiNovaSYBRGreenPCRKit采用干冰保存运输。收货后宜立即置于–15℃至–30℃恒温冷冻柜中避光保存。请务必遵照上述储存条件并正确处理，否则无法保证试剂盒在保质期（见包装盒内或外包装上的质检标签）前的性能。QuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix、QuantiNovaYellowTemplateDilutionBuffer和QNROXReferenceDye宜避光保存，可在2–8℃条件下稳定保存6个月，具体时间视保质期而异。QNROXReferenceDye可视需要加入到2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix中以便长期储存。有关详情，请参阅第5页“向预混液中添加ROX染料”部分。QuantiNovaSYBRGreenPCR用户手册03/20163产品规格2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix包含：组分描述QuantiNovaDNAPolymeraseQuantiNovaDNAPolymerase是一种最初提取自水生栖热菌的改良型重组94kDaDNA聚合酶，以非活化状态提供，在室温下无酶活性，可经由2分钟、95°C热启动步骤活化。QuantiNovaSYBRGreenPCRBuffer包含Tris、NH4+、K+、Mg2+和有助于加速反应循环的添加剂dNTPmix包含超纯品质的dATP、dCTP、dGTP和dTTP荧光染料SYBRGreenIQNROXReferenceDye经优化的荧光染料浓度，确保所有AppliedBiosystems®仪器上的荧光信号均一化QuantiNovaYellowTemplateDilutionBuffer超纯级、PCR级RNase-Free水超纯级、PCR级原理和步骤2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix的组分包括QuantiNovaDNAPolymerase和QuantiNovaSYBRGreenPCRBuffer。这款优化的预混液可确保超快、高特异性和灵敏度的实时PCR扩增。新型抗体介导的热启动机制QuantiNovaDNAPolymerase以非活化的状态提供，在室温下无酶活性。这一设计可防止在反应体系构建和第一个变性处理步骤过程中形成非特异性退火引物以及发生非特异性退火引物延伸，确保PCR结果高度特异、定量结果精确。在低温下，通过QuantiNovaAntibody和一款新型添加剂QuantiNovaGuard，可以保持复合物稳定，使QuantiNovaDNA聚合酶保持在非活化状态。这一特性确保了热启动的精确性。在2分钟内将温度升高至95°C，QuantiNovaAntibody和QuantiNovaGuard变性，DNA聚合酶激活，PCR扩增反应启动（图1）。热启动机制使您可以在室温下快速、方便地构建反应体系。4QuantiNovaSYBRGreenPCR用户手册03/2016内置可视的颜色染料确保正确移液QuantiNovaSYBRGreenPCRKit随附的预混液包含一种蓝色惰性染料，该染料不会干扰real-timePCR，但是可以增加管和孔的可视性，而QuantiNovaYellowTemplateDilutionBuffer则含有一种黄色染料。将采用QuantiNovaYellowTemplateDilutionBuffe稀释的模板核酸添加到预混液中，溶液的颜色由蓝变绿，从而为正确移液提供清晰的指示。客户可根据实际情况选择使用QuantiNovaYellowTemplateDilutionbuffer。QuantiNovaSYBRGreenPCRBufferQuantiNovaSYBRGreenPCRBuffer专用于采用SYBRGreenI进行的real-timePCR。这种缓冲液能够缩短任何实时定量PCR仪的反应循环时间，使得退火/延伸的综合步骤只需10秒。此外，独创的成分使之可兼容DNA溶解条件，有助于缩短变性和退火/延伸时间。该缓冲液同样也由QIAGEN独创的PCR缓冲液体系发展而来。它包含了K+和NH4+平衡离子组合，可在每个PCR循环的退火阶段促进特异性结合（相对于非特异性结合）比例。这一设计实现了严格的引物退火条件，进而增加了PCR特异性。使用这种缓冲液时，Mg2+浓度只会轻微影响引物退火反应，因此无需对Mg2+的浓度条件进行优化。SYBRGreenI2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix包含一种浓度经过优化的荧光性染料SYBRGreenI。SYBRGreen可与所有双链DNA分子结合，并在结合时发出荧光信号。2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix可在–20°C下储存而不会损失SYBRGreen荧光活性。SYBRGreenI的最大荧光激发和发射波长分别为494nm和521nm，可与任何实时定量PCR仪兼容。阴性参比染料对于某些PCR仪，如果real-timePCR反应体系之中存在ROX阴性参比染料，即可补偿荧光检测结果中非PCR相关的数据波动。在real-timePCR反应过程中，来自ROX染料的荧光不仅不会发生变化，还可为PCR相关的荧光信号的标准化处理提供一个稳定的基准。因此，ROX染料可以补偿由于轻微的反应体积变化或孔位置差异而引起的荧光检测结果差异。ROX染料不会干扰real-timePCR，因为它并不参与反应，且其发射光谱也与SYBRGreenI不同。非活化状态的QuantiNovaDNA聚合酶活化的QuantiNovaDNA聚合酶95°C下2分钟热启动QuanTiNovaDNAPolymeraseQuantiNovaAntibodyQuantiNovaGuardDNA图1.新型QuantiNova热启动机制原理。通过QuantiNovaAntibody和QuantiNovaGuard，使QuantiNovaDNAPolymerase在热启动步骤之前保持非活性状态。QuantiNovaSYBRGreenPCR用户手册03/20165AppliedBiosystems仪器必须使用ROX染料。QuantiNovaSYBRGreenPCRKit单独附带了一管QNROXReferenceDye。如果使用实时定量PCR仪并使用ROX作为阴性参比染料，可将其加入到real-timePCR反应体系之中。在需要高浓度ROX的仪器上使用时，应采用1xreal-timePCR样品1:10稀释QNROXReferenceDye；在需要低浓度ROX的仪器上使用时，需采用1xreal-timePCR样品1:200稀释QNROXReferenceDye。有关需要低浓度或高浓度的实时定量PCR仪的详情，请参阅表1。此外，您也可以根据需要将QNROXReferenceDye可添加到2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix中，以便长期储存（表2）。相关详请参阅第11页“向预混液中添加ROX染料”。表1.需要低/高浓度ROX的实时定量PCR仪表2.向预混液中添加QNROX染料高浓度ROX（在1x反应体系中，1:10稀释QNROXReferenceDye）低浓度ROX（在1x反应体系中，1:200稀释QNROXReferenceDye）ABIPRISM®7000AppliedBiosystems7500AppliedBiosystems7300AppliedBiosystemsViiA7AppliedBiosystems7900AppliedBiosystemsQuantStudio12KFlexAppliedBiosystemsStepOneAppliedBiosystemsStepOnePlus2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix体积（不含QNROXReferenceDye）高ROX浓度/低ROX浓度QNROXReferenceDye体积1ml200/10μl1.7ml340/17μl向预混液中添加ROX染料如果只会在AppliedBiosystems的PCR仪上使用QuantiNovaSYBRGreenPCRKit，可以根据需要向2xQuantiNovaSYBRGreenPCRMasterMix中加入QNROXReferenceDye，以便长期储存。如需了解各款AppliedBiosystems仪器所需的ROX浓度信息，请参阅表1。如需了解如何采用已添加高浓度QNROXReferenceDye的预混液构建反应，请参阅第10页“附录A：使用含有高浓度ROX的预混液构建反应”。用于实时、两步法RT-PCR的cDNA合成采用QuantiNovaSYBRGreenPCRKit定量cDNA靶标时首先必须将RNA反转录成cDNA，然后取相应量的反转录产物，转移到进行real-timePCR的另一试管中。因为反转录和real-timePCR发生在两个不同的试管中，故被称为两步法实时定量RT-PCR。进行反转录时，我们推荐使用QuantiTectReverseTranscriptionKit。该试剂盒采用快速、方便的操作流程，只需20分钟即可合成第一条链cDNA并去除基因组DNA污染。通过一种经过的oligo-dT和随机引物混合液，可以从RNA转录本之中的任何区域——甚至超长mRNA转录本的5'端区域——合成cDNA。此过程的cDNA得率非常高，甚至可对两步法实时定量RT-PCR之中的低丰度转录本进行灵敏地检测。如需了解订购信息，请参阅第11页。6QuantiNovaSYBRGreenPCR用户手册03/2016实验方案：Real-TimePCR和两步法RT-PCR实验须知•务必要首先确定本实验方案的反应条件，即便是要使用之前建立的引物体系。QuantiNovaSYBRGreenPCRKit针对两步法反应方案应用而开发，变性步骤在95°C下进行，退火/延伸综合步骤在60°C下进行。该实验方案同样适用于Tm低于60°C的引物•为确保采用SYBRGreen进行real-timePCR时具有最高效率，靶标的理想长度为60–200bp•PCR必须首先进行热启动步骤，即在95°C下孵育2分钟，激活QuantiNovaDNAPolymerase•对于96孔模块PCR仪，我们建议的反应物终体积为20μl对于384孔模块PCR仪，我们建议的反应物终体积为10μl•QuantiNovaYellowTemplateDilutionBuffer中的染料可以跟踪qPCR过程中加样的样品。这种染料加入到蓝色的SYBRGreenPCRMast