发酵工程原理与技术

发酵工程原理与技术第一章总论一、发酵工程的概念发酵的定义：利用生物细胞（含动物、植物和微生物细胞），在合适的条件下，经特定的代谢途径转变为所需产物或菌体的过程。发酵工程：是发酵原理与工程学的结合，是研究由生物细胞参与的工艺过程的原理和科学，是研究利用生物材料生产有用物质，服务于人类的一门综合性科学技术。发酵工程──利用微生物进行产品生产抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品化学工程生物化工生物加工行业传统生物技术现代生物技术基因工程菌发酵一、发酵工程的概念一般的，发酵工程又可称为微生物工程，但严格来说，发酵（微生物培养）只是发酵工程的一部分，而不是全部，但是其核心内容。通常，发酵工程分为两大部分：发酵部分：主要是通过一系列的环节，提供条件，使菌体生长繁殖，并产生发酵所要的目的产物（代谢产物）。提纯部分：这部分是通过一些物理的、化学的手段、方法，将代谢产物从发酵醪中提纯出来，获得最终产品。一、发酵工程的概念现代发酵工程是以天然生物体和人工修饰的生物体为加工对象，集现代化高新技术为一体，生产产品或服务于人类社会的一种工程技术。现代发酵工程加工的对象生物，除天然生物菌种和变异微生物菌株外，还有基因工程菌、细胞融合菌以及动植物细胞株。发酵工程的无菌概念已由原来的将杂菌排除再发酵系统外的单向概念转变为同时要求发酵系统内的生物体不能逸出系统外的双向概念。发酵的培养技术已不是简单的通气搅拌培养技术，而是要根据生物的类型、目的产物的特征不同而采用更复杂的培养技术，并引入了生化工程放大概念。二、发酵过程的特点和分类获得发酵产品的条件：适宜的微生物、保证或控制微生物进行代谢的各种条件、进行微生物发酵的设备、精制成产品的方法的设备。发酵过程的特点：1）发酵过程一般都在常温常压下进行的生化反应，反应条件比较温和。2）可采用廉价原材料，甚至可以利用废物为发酵原材料生产高附加值的产品。3）发酵过程是通过生物体的自适应调节来完成的，反应的专一性强，因而，可以得到单一的代谢产物。4）发酵工业相对投资较少，见效较快，具有经济和效能的统一性。二、发酵过程的特点和分类发酵过程分类：根据发酵对氧的需要：厌氧和有氧发酵根据发酵原料:糖质原料和烃类原料发酵根据发酵状态：液体和固体发酵根据发酵工艺类型：分批发酵和连续发酵根据产物类型：食品发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵、维生素发酵、抗生素发酵等三、发酵工业生产流程发酵工业生产过程主要包括：原料预处理培养基配制无菌空气的制备微生物菌种制备和扩大培养发酵发酵产品的分离和纯化发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品三、发酵工业生产流程发酵原料的预处理原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉——利用前需变成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜——加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐。3.碳氢化合物：石油脱蜡——一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10℃的油，加入适量无机盐进行接种发酵。三、发酵工业生产流程发酵培养基的配制与灭菌（1）目的要明确；（2）培养基的营养要协调；（3）pH要适宜。灭菌:主要采用高压水蒸汽直接对培养基进行加热灭菌，多采用121℃保温20-30min，然后冷却，这样称之为实罐灭菌；也可采用连续灭菌。三、发酵工业生产流程无菌空气制备一般采用无菌空气作为氧气来源，高空采风，经空气压缩机加压后采用加热灭菌或过滤除菌。微生物种子的制备一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。菌种筛选摇瓶试验发酵罐试验三、发酵工业生产流程发酵过程的操作方式三种模式：间歇发酵、连续发酵和流加发酵间歇发酵又称分批发酵，在发酵过程中，除气体进出外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。流加发酵是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。发酵产品及分离提纯工艺固液分离技术、细胞破碎技术、浓缩分离技术、精制技术、结晶技术等四、发酵工程的发展历史发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物1、发酵现象的早期认识1680年制成显微镜───微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精───酶四、发酵工程的发展历史2、发酵工程的早期阶段人们的对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）──由食品工业向非食品工业发展。3、发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。抗生素工业的发展，建立了一套完整的好氧发酵技术，推动了整个发酵工业的深入发展，现代发酵工程奠定了基础。四、发酵工程的发展历史3、发酵工程的重大转折点20世纪70年代，细胞融合技术、基因技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量。将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中，快速经济地大量生产这些产物。将具有不同性能的多种质粒植入，使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护。四、发酵工程的发展历史4、发酵工程产业化发展目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约7％～8％的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题。五、生物工程与发酵工程的关系发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心。发酵工程是生物技术产品走向工业化的必由之路。生物工程基因工程细胞工程酶工程产品发酵工程产物产品第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术第一节发酵工业微生物菌种的选育第二节工业微生物种子的扩大培养第三节种子培养基及其制备一、工业微生物的特点工业微生物是指在发酵工业上已经应用的或具有潜在应用价值的微生物，其范围随科学技术的发展而不断扩展。工业微生物的特点：个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造。第一节发酵工业微生物菌种的选育二、发酵工业常用微生物菌种及要求（一）发酵工业对菌种的要求1、能在廉价原料制备的培养基上迅速生长并生成所需的代谢产物，且产量高；2、培养条件易于控制；3、生长迅速，发酵周期短；4、满足代谢控制的要求；5、抗噬菌体和杂菌能力强；二、发酵工业常用微生物菌种及要求（一）发酵工业对菌种的要求6、遗传性状稳定，菌种不易变异退化；7、在发酵过程中产生的泡沫要少；8、对需要添加的前体物质有耐受能力；并且不能将这些前体物质作为一般碳源使用；9、不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质（包括抗生素、激素和病毒）以保证安全。（二）工业生产常用的微生物菌种1、细菌（Bacteria）细菌是单细胞原核生物，具有环状DNA染色体，以典型的二分分裂方式繁殖。(1)球细菌根据形态可分为三类：(2)杆细菌(3)螺旋细菌工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状单细胞原核生物。因菌落呈放射状而得名2、放线菌（Actinomycetes）抗生素有60％以上是放线菌产生的工业生产常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属、诺卡菌属3、酵母菌（Yeast）酵母菌是单细胞真核生物，常以出芽方式进行无性繁殖。c、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母”属半知菌。a、形成子囊孢子的株系属于子囊菌门根据产生孢子的能力，可将酵母分成三类：b、形成担孢子的株系属于担子菌门(黑粉菌目)工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等4、霉菌（mould）霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。工业上常用的霉菌有：藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉子囊菌纲：红曲霉半知菌类：曲霉，青霉。5、担子菌（Basidiomycetes）担子菌是会产生担子和担孢子的真菌。担子菌主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。6、藻类（Alga）许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。6、藻类（Alga）螺旋藻栅列藻单孢藻三、发酵工业微生物菌种的分离和选育（一）微生物菌种的分离1、施加选择压力分离法施加选择压力分离法是利用不同种类的微生物的生长繁殖对环境和营养（如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等）的要求不同，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。使用高糖或高盐培养基进行培养，可获得耐高渗透压的微生物控制培养基的各种营养成分（如使某种碳源、氮源成为唯一的碳源、氮源），可使能利用此种营养的微生物富集，从而大量获得控制不同的pH条件，可分离出嗜酸和嗜碱微生物在高温下培养，将嗜热微生物和非嗜热微生物分开控制培养时的氧气，将好氧微生物和厌氧微生物分开在分离培养基中加入不同的抗生素或试剂来增加选择性具体培养方法有两种方式：1、分批式富集培养（摇瓶培养）2、恒化式富集培养（连续培养）重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离出来。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。2、随机分离方法（1）抗生素产生菌的分离抑菌圈法:工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。如春雷霉素和青霉素等。除使用高灵敏度的工具菌外，可以利用专一性很强的酶，酶抑制剂，激活剂，抗体等建立高灵敏度，专一的筛选技术。（2）抗肿瘤药物产生菌的分离临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。1生化诱导分析法（BIA）2SOS显色法原理一：生物体中都存在两个以上的DNA修复基因，如果一个DNA修复基因损伤或变异，通常仍能存活，但对能引起DNA损伤的化合物十分敏感，易发生死亡，所以可以利用DNA修复能力突变株筛选抗肿瘤药物。实践中常使用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的重组缺失DNA修复基因突变株和亲株作为测试菌来筛选抗肿瘤药物。原理二：（3）酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂的生产主要是为了治疗某些疾病，如为治疗糖尿病需要α－糖苷酶抑制剂（阻止淀粉等分解为可被吸收的单糖），为治疗肥胖需要脂肪酶抑制剂（阻止对摄入的脂肪物质的消化吸收）等等。酶抑制剂产生菌的筛选，主要以所需抑制的酶为靶酶进行筛选。如果某种化合物能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用，所以可以在体外进行筛选。例：α－糖苷酶抑制剂产生菌分离α－糖苷酶