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第8章酶8.1概述1.酶的组成酶蛋白全酶辅酶辅因子辅基2.酶的分类按照催化反应的类型，国际酶学委员会将酶分为六大类。在这六大类里，又各自分为若干亚类，亚类下又分小组(次亚类)、小组后是酶的编号，一共四个分类层次。这种分类法为每种酶规定了统一的编号。酶的编号由EC和4个用圆点隔开的数字组成，每一个分类层次都用一个数字与之对应，这样，每一种酶可以用4个阿拉伯数字来代表。EC表示酶学委员会，第一个数字表示酶的大类，第二个数字表示酶的亚类，第三个数字表示酶的小组，第四个数字表示酶在小组中的序列号。过氧化氢酶：EC1.11.1.6转化酶:EC3.2.1.26多功能酶可以有多个编号。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH1.氧化-还原酶Oxidoreductase氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO2.转移酶Transferase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH3.水解酶Hydrolase水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，酯酶(Esterase)催化的酯的水解反应根据酶切部位，水解酶可分为内切酶和外切酶。内切酶从聚合物长链分子的内部将分子切断；外切酶则从长链分子的一端依次切下一个单位。HOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH4.裂合酶Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。OCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH5.异构酶Isomerase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。6.合成酶LigaseorSynthetase合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H2O=AB+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应丙酮酸+CO2草酰乙酸五、酶的活力1.酶活力的定义：指酶催化一定化学反应的能力。2.活力单位：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。在25℃及其他酶最适条件下，在1min内1μmol的底物转化为产物的酶量称为酶的国际单位（IU）比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是u/mg。比活越高则酶越纯。转化数：每分子酶或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)。也称为催化常数（Kcat）。1/Kcat称为催化周期。碳酸酐酶是已知转换数最高的酶之一，高达36×106每分钟，催化周期为1.7微秒。二、酶的活性中心1.定义酶是大分子，直接与底物接触并起催化作用的只是酶分子中的一小部分。因此，人们认为，酶分子中有一个活性中心，它是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。活性中心是有酶分子中少数几个氨基酸残基构成的它们在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同的肽链上，由于肽链的盘曲折叠而互相接近，构成一个特定的活性结构。因此活性中心不是一个点或面，而是一个小的空间区域。2.分类活性中心包括底物结合部位和催化部位前者负责识别特定的底物并与之结合。后者起催化作用结合部位决定酶的专一性。催化部位决定酶所催化反应的性质活性中心以外的部分并不是无用的，它们能够维持酶的空间结构，使活性中心保持完整。在酶与底物结合后，整个酶分子的构象发生变化，这种扭动的张力使底物化学键容易断裂。这种变化也要依靠非活性中心的协同作用。“诱导契合学说”,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状当酶与底物接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生改变，变得有利于与底物结合和催化。因此该学说认为酶分子的构象不是刚性的，而是柔性的。Ｅ＋Ｓ＝ＥＳ＝Ｅ＋Ｐv=Vmax×[S]/(Km+[S])Vmax=k2[E]0[E]=[E]0-[ES]k1k28.2酶促反应动力学一、米氏方程米氏常数的意义米氏常数的物理意义是反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数，不随反应中加入酶的多少以及底物浓度的高低而变。双倒数作图法将方程改写为1/v=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax实验时在不同的底物浓度测定初速度，以1/v对1/[S]作图，直线外推与横轴相交，横轴截踞为-1/Km，纵轴截踞为1/Vmax。此法称为Lineweaver-Burk作图法，应用最广，但实验点常集中在左端，作图不易准确。米氏常数的测定三、影响酶促反应速度的因素1.底物浓度对酶促反应速度影响在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如后图所示：在低底物浓度时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值(Vmax)，此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。根据上图，请说明在测定酶活时，底物浓度多高比较合适？2.pH的影响大部分酶促反应速度受pH值的影响，某一特定的酶在一定的pH值条件下活力最高，该pH值称为该酶的最适pH。偏离最适pH酶的活力都会降低。一般酶的最适pH在6－8，少数酶需偏酸或碱性条件。如胃蛋白酶最适pH在1.5，而肝精氨酸酶在9.7。pH影响酶的构象，也影响与催化有关基团的解离状况及底物分子的解离状态。最适pH有时因底物种类、浓度及缓冲溶液成分不同而变化，不是完全不变的。大部分酶的pH-酶活曲线是钟形曲线，但也有少数酶只有钟形的一半，甚至是直线。如木瓜蛋白酶底物的电荷变化对催化没有影响，在pH4-10之间是一条直线。3.温度的影响酶促反应速度随温度变化的曲线是钟形曲线，即温度较低时，酶促反应速度随温度的升高而加速；温度高到某一点以后，如果继续升高，则酶促反应速度反而下降。也就是说有一个与最高反应速度相对应的温度，此温度即最适温度。最适温度是温度升高时化学反应加速与酶失活综合平衡的结果。一般酶在60℃以上变性，少数酶可耐高温，如牛胰核糖核酸酶加热到100℃仍不失活。干燥的酶耐受高温，而液态酶失活快。温血动物的酶最适温度是35－40℃，植物酶在40－50℃。最适温度也不是固定值，它受反应时间影响。酶可在短时间内耐受较高温度，时间延长则最适温度降低。102030405060708090020406080100TemperatureOCRelativeActivity(%)4.酶浓度对酶反应的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有酶抑制剂及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比。对于一个酶促反应体系来说，是否加入酶越多反应速度就越快？为什么？测定一种酶的活力时，在测定体系中加入多少酶合适？5.激活剂(activator)的影响凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂。大部分激活剂是离子或简单有机化合物。激活剂包括：金属离子（钾、钠、钙、镁、锌、铁等，原子序数在11－55之间）、氢离子和阴离子。金属离子中镁是多种激酶及合成酶的激活剂。6.抑制剂（inhibitor）的作用使酶活力下降，但不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。能引起抑制作用的物质叫做酶的抑制剂。抑制剂与酶分子上的某些必需基团反应，引起酶活力下降，甚至丧失，但并不使酶变性。抑制作用可分为可逆抑制与不可逆抑制。食品中的酶是引起食品质量变化的重要原因，例如:果蔬发生酶促褐变制作豆奶时产生豆腥味果蔬在储藏中变软搞清楚与食品质量变化相关的酶的性质，可以帮助我们更好地控制食品的质量变化。研究食品中酶的意义另外，我们也可以主动地将酶学原理及酶制剂用于食品加工，食品检测，食品保藏等方面，例如：生产淀粉糖生产果汁利用葡萄糖氧化酶去除食品体系中的氧气利用各种酶电极检测食品中的有关成分8.3酶促褐变褐变：包括酶促褐变和非酶褐变。酶促褐变现象：当果蔬受到损伤时，组织和氧接触，由酶催化造成变色。例子：切开的马铃薯、苹果等切面会发黑。对虾死后，虾头很容易发黑。酶促褐变定义：酚酶催化酚类物质形成醌类物质及其聚合物的过程。酶促褐变的意义:有利:茶叶、可可豆不利:影响食品色泽和风味。8.3.1酶促褐变的机理多酚氧化酶（polyphenoloxidase）多酚氧化酶（EC1.10.3.1），存在于植物、动物、微生物组织中，以铜离子为辅基，在有氧条件下发生酶促褐变。正常情况下，植物组织中有较高的还原势，酚—醌之间保持平衡，醌也不会聚合成黑色素。水果和蔬菜在采收后，组织发生机械损伤或处于异常环境时，果蔬中原有的酚—醌之间的氧化还原平衡被破坏，导致氧化产物积累，造成果蔬变色。这类反应的速度非常快，一般需要和空气接触，由酶催化，因此称为酶促褐变。酚酶可以以一元酚或二元酚为底物。有人认为酚酶是兼能作用于一元酚和二元酚的一种酶；也有人认为酚酶是一个多酶体系，一种是酚羟化酶，另一种是多酚氧化酶。多酚氧化酶（PPO）能催化两类不同的反应：羟基化反应：可以使一元酚羟基化，生成邻二羟基化合物——酚羟化酶（或甲酚酶）活性。氧化反应：也可以氧化邻苯二酚生成醌——多元酚氧化酶（儿茶酚酶）活性。•反应生成的邻苯醌类化合物再经非酶促氧化成为黑色素。酶促褐变的底物：一元酚、邻二酚类(儿茶素等)、黄酮类化合物、花青素、单宁等。氧气酚类化合物醌类化合物→聚合作用→黑色素酚酶、氧去皮和切分是果蔬加工的两个重要操作在此操作过程中果蔬组织细胞受到损伤，酚类物质流到切分果蔬表面与氧化酶接触当有氧气存在时酚类物质在氧化酶的作用下氧化迅速褐变生成邻醌，后者快速聚合成褐色或黑色的色素。在各种酚类底物中，反应最快的是邻羟基结构的酚类，对位二酚类也可氧化，但间位二酚则不能被氧化。HOHOHOOHOHOH鲜切山药PPO对不同酚类底物的Km值(mmoL/L)底物绿原酸酪氨酸焦性没食子酸Km值0.354.366.24底物愈创木酚苯酚儿茶酚Km值10.7811.350.57酚类底物的结合能力依次为：绿原酸＞儿茶酚＞酪氨酸＞焦性没食子酸＞愈创木酚＞苯酚8.3.2防止酶促褐变的措施：酶促褐变发生的三个要素：酚酶氧酚类底物钝化酶(热烫、抑制剂)改变酶的作用条件(pH值、水分活度)隔绝氧气使用抗氧化剂(抗坏血酸、二氧化硫等)添加底物类似物（竞争性抑制剂）加热钝化酶活——水煮、蒸汽、微波等处理加热程度：理论值90～95℃7s。不可过热和时间过长，否则会引起物料组织结构过分破坏；加热程度过低促进褐变温度对PPO活性的影响板栗:90～100℃处理1min，酶活性基本消失酸处理法酚酶等最适pH在6～7之间，低于3.0已基本无活性。常用柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、磷酸等柠檬酸可与酚酶的铜离子螯合苹果酸抑制效果比柠檬酸强抗坏血酸两种抑制机理（还原和降低pH）pH与PPO活性的关系甘薯:最适为6.0～7.0,在pH3.0～3.5之间有一个次峰,这可能是由于同工酶的存在。从总体看,在pH3～7之间较强,在pH4.5左右时处于区间最小值。板栗:最适pH为4.1～5.24,近中性pH为6.20～6.65有较稳定的酶活性(肩峰),说明板栗中可能有PPO同工酶的存在。添加抑制剂多酚氧化酶的抑制剂主要包括：(1)金属离子螯合剂，如植酸、EDTA、柠檬酸、苯甲酸等(2)醌类物质还原剂，如维生素C、SO2、亚硫酸氢钠、巯基化合物等(