色谱柱应用问题排查及使用维护

©2011WatersCorporation色谱应用问题排查与柱使用维护沃特世消耗品部[e-mail]©2011WatersCorporation2新柱和/或项目开始之前……？色谱柱刚使用就出现问题……！色谱柱的维护与保养……？Agenda©2011WatersCorporation3新柱和/或项目开始之前—了解你的色谱柱—色谱柱的安装—测试色谱柱的柱效色谱柱刚就出现问题……！色谱柱的维护与保养……？Agenda©2011WatersCorporation填装良好的色谱柱在系统、连接状况皆良好的状况下，色谱峰形很好了解你的色谱柱：色谱柱维护使用指南书©2011WatersCorporation5色谱柱的安装色谱柱：—色谱柱封存时，应使用合适匹配的柱封堵头—如柱封堵头不匹配或未拧紧，可能导致溶剂部分挥发，柱床部分干涸好的操作习惯：—总是从纯有机溶剂、低流速开始（避免对柱压力骤然升高）—仅连接柱入口端、纯有机溶剂、低流速：检查是否存在柱干涸情况—如存在柱干涸：充分排除柱内气泡，避免进入检测器—如存在柱干涸：继续用纯有机溶剂、低流速浸润柱©2011WatersCorporation6柱安装的正确操作©2011WatersCorporation7新项目开始前，进行柱效检测的必要性确认色谱柱和仪器状态良好©2011WatersCorporation8测试色谱柱的柱效不测试柱效的“后果”：-如柱效不佳，将浪费对实际样品的分析测试时间、问题排查时间，甚至宝贵样品；-所得数据：无效，并将难以重现；-对于新柱，如柱效不佳，难以判断是否是样品或流动相污染所造成；-建议新柱在到货后，即进行柱效测试，如有疑问，及时与供应商联系排查。©2011WatersCorporation9影响色谱柱柱效表达的系统因素影响柱效的系统因素：-系统死体积，包括系统中过长冗余的管路、或管路内径过大不合适，等等；-不合适的管路与柱的连接；-检测器采样频率过低。（摘自SunFire维护使用说明书）（摘自Xbridge维护使用说明书）©2011WatersCorporation塔板数是反映色谱柱以及仪器性能状态的关键参数A12,0007,000相同色谱柱仪器A：谱带展宽较小（70µL）测出的塔板数较高（12,000）仪器B：谱带展宽较大（130µL）测出的塔板数较低（7,000）B新柱柱效测定结果系统对柱效的影响©2011WatersCorporation11『实例』某药企Propiophenone苯丙酮(中性)Propiophenone苯丙酮(中性)仪器型号：岛津LC-2010-CHT色谱柱：XBridgePhenyl3.5um4.6*100mmUSPtemplate:5856Tailing:1.27©2011WatersCorporation12柱效测试COAUSPtemplate:12679Tailing:1.12©2011WatersCorporation13更换仪器后Propiophenone苯丙酮(中性)Propiophenone苯丙酮(中性)仪器型号：Waters2695色谱柱：XBridgePhenyl3.5um4.6*100mmUSPtemplate:11000©2011WatersCorporation14谱带展宽vs系统死体积死体积谱带展宽©2011WatersCorporation15死体积Importantfortransferringmethods—SystemshavedifferentvolumesAffectsearlyelutingpeaksDiffersinhighandlowpressuremixingRelatestoruntimeandgradientformation谱带展宽ControlsbandspreadingAffectsallpeaksAllowssmallIDcolumnstobeusedRelatestopeakwidthandefficiency谱带展宽vs死体积©2011WatersCorporation下图是用0.04″内径的管路连接时测柱效的色谱图：柱效：4000上图是用0.009″内径的管路连接时测柱效的色谱图：柱效：1,1000注：使用相同色谱柱实例：管线内径对柱效的影响—在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线©2011WatersCorporation0.0090.0200.040连接管线的内径对系统谱带展宽的影响注：过长的管线亦会造成较大的谱带展宽样品谱带在管线内发生了扩散实例：管线内径对柱效的影响©2011WatersCorporation谱带展宽连接适当连接不妥由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题色谱柱安装及连接的机械因素-连接连接不妥，造成漏液©2011WatersCorporation0.000.020.040.060.080.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.000.020.040.060.080.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.000.020.040.060.080.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.000.020.040.060.080.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.000.020.040.060.080.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50A=10A=5A=2A=1A=0.5检测器采样频率对峰形与柱效表达的影响采样速率研究（点/秒）—超快色谱—不同的采样速率采样速率:—当色谱峰宽为1秒时，需使用大于等于10点/秒的采样速率—在通常的情况下，每个色谱峰需要采集20个点以上时间常数为0.1secs时间常数为10secs左侧色谱图噪音较大，但是分辨率更好©2011WatersCorporation20新项目开始前，进行柱效检测的必要性确认色谱柱和仪器状态良好不测试柱效的“后果”：-如柱效不佳、和/或系统存在问题，将：1.浪费柱平衡、进样检测、问题排查所耗费的时间与人力物力，甚至宝贵样品；2.所获得的数据：无效，并将难以重现；-如新柱柱效较低，同时检查系统死体积、柱连接、检测器状态及采样速率-如新柱保留值与出厂值相差很大（检测方法相同），很可能是因为系统所造成（例如比例阀失当、泵密封圈渗液），需要及时排查并维护，否则数据稳定性和重现性差©2011WatersCorporation21新柱和/或项目开始之前……色谱柱刚使用就出现问题……！色谱柱的维护与保养……？Agenda©2011WatersCorporation22查看谱图，将问题分为两类：—谱图中的所有峰形都不理想—谱图中只有个别峰形不理想新柱使用时出现的问题排查©2011WatersCorporation23当峰形都不理想时51510Min.样品溶解在水中0.04AU123样品溶于80%甲醇及2%甲酸中151230.02AU©2011WatersCorporation24按柱效测试结果不理想时的原因进行排查：—柱效低（色谱柱）—系统死体积过大（系统）—不合适的管路及柱-管路连接（系统）—采样频率过低（系统）如果刚测过柱效柱效正常，且系统设置未更改过，就可以排除以上考虑样品溶剂展宽效应样品/流动相污染及排查当发生岔头峰时色谱柱刚使用，当所有峰形都不理想时：©2011WatersCorporation注意“溶剂展宽效应”：当样品溶剂强度流动相起始条件时溶解样品的溶剂不正确—洗脱强度比流动相强©2011WatersCorporation样品/流动相污染及排查色谱峰形问题：展宽且拖尾的色谱峰—在线过滤器污染o更换筛板—保护柱污染o更换保护柱或柱芯o使用保护柱并及时更换是好的操作规范！—色谱柱进口过滤器（筛板）部分阻塞o卸下接头，清洗或更换筛板o更换流动相和溶剂瓶，彻底清洗系统通常伴随明显的压力升高现象！©2011WatersCorporation相同保护柱与色谱柱：第950次进样更换新SentryGuard保护柱：第951次进样使用配SymmetryC8保护柱的色谱柱：首次进样色谱柱头容易受到污染，使用保护柱延长色谱寿命©2011WatersCorporation色谱柱内空隙－高反压，扭曲的或双峰相似的变化当所有色谱峰都呈现岔头峰（新柱），已排除系统连接、保护柱污染等问题时……©2011WatersCorporation填料塌陷柱头形成死体积高pH条件溶解填料，造成柱头填料空缺©2011WatersCorporation30AU-Minutes051520AUMinutes051520第2针第40针C18色谱柱高pH柱寿命测试pH12磷酸盐缓冲溶液,30oC某C18色谱柱号称能耐受pH1-12进样2次后进样400次后XBridgeC18柱©2011WatersCorporation色谱柱塌陷的主要原因原因之一；化学伤害造成色谱填料的损坏—pH8时，硅胶基质被溶解，引起柱头填料塌陷空缺—检查流动相pH值，以及样品溶液pH值原因之二；机械损伤造成色谱柱床受到干扰—剧烈撞击（如意外落地），色谱柱床中出现裂缝—压力的突然变化、超压（包括柱部分干涸时直接加压使用！）好的操作习惯可以预防问题的发生！！—了解你的色谱柱，仅使用合适的条件—使用保护柱，减少化学伤害—正确的柱安装，避免柱部分干涸时的直接加压使用©2011WatersCorporation32沃特世色谱柱产品进程研发、生产与质控能力Styragel®µBondapak™DeltaPak®1964197919731992Symmetry®Spherisorb®Atlantis®Symmetry®300XTerra®XTerraPrep®1998Nova-Pak®ProteinPakTMPico-TagTMSymmetryShield®198419862002199919942003Atlantis®HILICSilicaPrepOBD™IntelligentSpeedTMBioSuite™NanoEase™2004ACQUITYUPLC®BEHSunFire™ColumnsPrepPak®19761958Atlantis®T3ACQUITYUPLC®HSST3AccQTagTMUltra20062005XBridge™2007ACQUITYUPLC®HSSC18andHSSC18SB2008XBridge™HILIC2009ACQUITYUPLC®BEHAmideACQUITYUPLC®BEHGlycanXBridgeAmideHSSHPLCColumns2010ACQUITYUPLC®BEH200SECXSelectCSHHPLCcolumnsACQUITYCSHColumnsViridisSFCColumnsProteinPakHighRsIEXAccQTagTM2011ACQUITYUPLC®HSSCyano/PFPcolumnsXSelectTMHSSCyano/PFPcolumnsXPcolumns从1994年行业标杆性产品Symmetry开始，沃特世完全自行生产高纯硅胶与杂化颗粒基质。不断推陈出新的研发能力，配合高度自动化的生产能力、与全面严格的质控能力，确保产品的高新技术能力与完美品质。10um不定形硅胶！仍在延续使用！©2011WatersCorporation33当所有峰形都不理想时：—按柱效测试结果不理想时的可能原因进行排查—样品溶剂展宽效应—样品/流动相污染及排查—当发生岔头峰时—GoodPractice！对新柱和/或项目开始之前，先进行柱效测试确认柱状态正常。当个别峰形不理想时……—反相色谱柱：中等pH条件？碱性分析物？离子交换次级作用—样品组分过载色谱柱刚使用的问题排查©2011W