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1免疫毒性试验的指导原则（草案）本指导原则是为了有助于药品安全性的正确评价，对申报药品审评时所做免疫毒性试验提供的标准实施方法。但是。对于所有的药品进行完全一样的免疫毒性试验，有时也不尽合理，重要的是：应根据对象药品的特性采用最适宜的试验方法。[背景]在清除细菌和病毒等外来病原体以及体内产生的癌细胞等，并维持生体正常的过程中，免疫系统起着重要的作用。免疫功能低下容易导致机会感染和产生肿瘤，这在免疫功能缺乏症和获得性免疫功能缺乏综合征（AIDS）的病例中是人们所熟知的。对免疫系统的有害作用（免疫毒性）与其他毒性不同，与其说是其直接对患者的生存带来威胁，不如说由外来病原体的侵袭和内在性癌细胞的发生时产生的免疫毒性更有害。关于药品审评申报的非临床免疫毒性试验，虽然指出了其重要性，但是，构成免疫系统的细胞组织及其相互作用是复杂的，免疫功能的评价项目很多，除小鼠之外的试验动物，特别是毒性试验中通常使用的大鼠，其免疫功能试验方法的评价尚未充分进行，这些都是实情，而且免疫功能试验方法的设定较迟。然而，近十年间，包括国际性的共同研究，免疫毒性试验方法的评价取得了较大的进步，即便是使用大鼠进行的免疫毒性试验，也进入了堪称充分而实用的阶段。在本指导原则中，利用具有免疫毒性的诸多化学物质在反复给药毒性试验时与免疫毒性有关的检查项目中出现异常的现象，其原则是，根据反复给药毒性试验的结果，在怀疑存在免疫毒性的场合下，进而再做免疫毒性试验。免疫毒性包括抑制免疫功能、变态反应、自体免疫以及其他的免疫功能异常亢进等，但本指导原则并未将试验药物特异性的免疫反应（药物变态反应和药物特异性的自体免疫）作为研究对象。（注1）2根据本指导原则，在符合表1的某一项时，必须进行免疫毒性试验。生物制品及应用生物技术的药品不列入本指导原则的对象。[指导原则的目的]为了有效地进行药物免疫毒性的检查及其性质的研究，必须根据预测的免疫毒性选择最适宜的试验方法和拟定实验方案。本指导原则的目的是提供进行非临床免疫毒性试验时可供参考的实验程序和检查项目的选择标准。本指导原则中，作为检查免疫毒性的试验，是在过去一直沿用反复给药毒性试验的基础上，增设第1阶段免疫毒性试验（第1阶段试验）及第2阶段免疫毒性试验（第2阶段试验）。包括与反复给药毒性试验相关的免疫毒性的检查项目和第1阶段试验的主要目的是筛选药物，这些药物对免疫系统可能会显示出直接或间接的毒性。在第1阶段试验中可以同时了解对体液性免疫的影响；第2阶段试验的目的在于从质量上和数量上证明免疫毒性的大小程度。关于免疫毒性试验的实施方法，其技术进步很快，可以预料：比本指导原则所记述的试验法更为优异的方法即将被开发。当着人们进行试验之际，在参考本指导原则的同时，还应经常获取新技术，努力改进检查方法。[检查项目的选择]本指导原则所列示的检查项目被认为是最低限度的要求，根据试验药物的不同性质，可以考虑适当增加检查项目。反复给药毒性试验的免疫毒性有关检查项目为脏器重量、血液检查（血液学检查及血液化验）以及组织病理学检查中与免疫系统有关的项目。同时，在反复给药的毒性试验中，建议增加末梢血液淋巴细胞亚群检查及脾脏免疫组织化验等项目（表2-1）。从反复给药毒性试验的免疫毒性有关检查项目及增加的检查项目中发现异常时（注2），才作免疫毒性试验。免疫毒性试验分为2个阶段。第1阶段试验进行抗体生成的检查以及脾脏和胸腺脏器重量测定等检查（表2-2）。天然杀伤细胞（NK）活性的检查最好补充到第1阶段试验中。3第1阶段试验未见异常的时，可以不进行第2阶段试验。第1阶段试验出现异常时，结合反复给药毒性试验的结果后，进行包括适当检查项目（表2-3）在内的第2阶段试验。在第2阶段试验中，必须证明所列免疫毒性的性质，特别应弄清对受影响细胞和免疫功能鉴别的影响强度，这是尤为重要！。反复给药毒性试验中，断定出现明确的免疫毒性，并从其毒性性质而言进行第1阶段试验的必要性很小时（注3），可直接进行第2阶段试验。为了讨论免疫毒性的可逆行，根据需要可对发现异常的项目进行恢复性试验。[试验实施的时期]通常第1阶段试验在反复给药毒性试验之后进行，若有可能，也可以和反复给药毒性试验同时进行。第1阶段试验，原则上应在临床试验开始以前进行；第2阶段试验，根据需要可在适宜的时期内进行。[试验方案]第1阶段试验的试验方案应遵照以下条件，需要进行第2阶段试验的场合，应当制定与其目的最相宜的实验方案。1.动物种类、性别及周龄：最好使用与反复给药毒性试验的免疫毒性有关检查项目及增加的检查项目中发现异常的动物为同一物种、相同种系、一样的性别和周龄的动物（注4）。反复给药毒性试验中未见雌雄差异时，可以使用雌雄中的任意一种动物（注5）。2.动物数量：每组不少于8只，应当设定为在统计学具有足够数量的动物数。各组动物的分配采用随机分组法。3.给药途径：原则上为临床应用的给药途径。4.剂量等级：原则上应当设定不低于3种剂量的给药组，并另设对照组。参照反复给药毒性试验的免疫毒性有关检查项目及增加的检查项目中发现异常时的剂量，设定剂量的等级（注6）。5.对照组：设置仅用溶剂的阴性对照组。根据需要可以考虑增加正常对照组（注7）及阳性对照组（注8）。46.给药期间：原则上采用反复给药毒性试验为基准的给药期间。通常每周给药7次。7.观察等：进行一般症状的观察及体重测定。[与免疫毒性有关的检查项目]在反复给药毒性试验及免疫毒性试验中，作为研究对象的免疫毒性有关检查项目见表-2。根据试验药物的性质及试验的目的，可从这些检查项目中选择需要的项目，制定切实可行的试验方案。[注释]注1：关于迟发型药物变态反应，皮肤过敏试验的指导原则已经制定，但是速发型药物变态反应的能够很好预测的试验方法迄今尚未建立。注2：表-1第1项（1）的内容是指怀疑出现免疫毒性的场合。所谓免疫毒性有关检查的异常是指在该项检查中给药组与阴性对照组之间存在统计学意义的明显差异，但应考虑试验动物的标准数据等的范围及其变化。注3：例如，仅仅发现嗜中性白细胞减少，未见其他异常的场合等。注4：通常使用小鼠及大鼠。注5：在同一笼子中饲养多只雄性动物时，应当考虑笼子的大小，使之不会发生打斗等饲养方面的问题。注6：高剂量组是将与对照组比较体重抑制不超过10%的用药量作为本组的剂量。设计剂量时必须做到：高剂量组应出现足够多的异常，而低高剂量组不应发生异常，希望得出给药剂量与动物反应的某种关系。高剂量组异常的变化很小，明确知道无须使用3种等级的剂量时，也可以使用2种剂量的给药组。注7：通常没有必要，但是所用溶剂对免疫毒性试验产生影响时，必须设置正常对照组。注8：设置阳性对照组的目的在于评价检查手段是否妥当。如果采用了另一种方法进行试验，即：使用少量动物观察给予环磷酰胺等阳性对照药物后的影响，则可省去该阳性对照组。5[参考文献]1）.种种の试验法にして，MethodsinImmunotoxicologyVols.1and2(ed.byBurleson,G.R.,et.al.);EnvironmentalHealthGriteria180.PrinciplesandMethodsforAssessingDirectImmunotoxicityAssociatedwithExposuretoGhemical.pp.164_225(1996);ImmunoToxLetter.（日本免疫毒性学会发行）に揭载の免疫毒性试验プロトコ-ル等を参照すること。6表-1本指导原则中免疫毒性试验的对象药物1．依据下述（1）至（3）的任意一项，均被怀疑为试验药物存在免疫毒性时：（1）该品反复给药毒性试验及其他毒性试验的结果；（2）与具有免疫毒性的已知药物的化学结构相似；（3）其他情况。2.试验药物的临床应用符合于下列（1）至（2）的场合（注1）：（1）免疫功能缺失症；（2）与具有免疫抑制作用的药物（注2）联合用药。注1：具有合理理由时，可从试验对象中排除。注2：免疫抑制剂、抗癌药物、抗变态反应药物及甾体化合物等中具有免疫抑制作用的药物。表-2免疫毒性的有关检查项目Ⅰ.反复给药毒性试验的检查项目1.一般状态及体重；2.血液学检查：免疫毒性的有关检查必须进行血细胞计数和测定白细胞的分类百分率。3,血液化验：免疫毒性的有关检查必须测定白蛋白/球蛋白比率（A/G）。4.脏器重量：免疫毒性的有关检查必须测定脾脏、胸腺及肾上腺的重量。5.组织病理学检查：免疫毒性的有关检查必须进行脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、肠道（包括淋巴集结）、肝脏、肾脏、肾上腺及皮肤的检查。6.最好增加末梢血液淋巴细胞亚群检查及脾脏免疫组织化验等项目。Ⅱ.第1阶段免疫毒性试验的检查项目1.抗体的生成：在给药过程中的适宜时期，使用羊的红细胞等T淋巴细胞依赖性抗原进行免疫。将羊的红细胞作为抗原使用，在空斑形成细胞（PFC）测定时，4天前测定血清的抗体值，6—7天前进行免疫。由羊的红细胞进行免疫采用静脉内给药。测定空斑形成细胞（PFC），最后一次给予试验药物的第2天，制作每只动物的脾脏细胞，并进行测定。测定血清抗体时，最后一次给予试验药物的第2天，采集每只动物的血液，制作血清，一直保存到7测定之时（根据需要可以冷冻）。抗体的测定采用酶标记免疫吸附测定法（ELISA）。2.用于抗体生成检查的试验动物，应进行一般状态、体重、脾脏重量、胸腺重量以及其他一些特殊需要的项目进行检查。3.根据需要，可以进行天然杀伤细胞（NK）的检查。为了进行天然杀伤细胞（NK）的检查，与抗体生成的检查不同，必须设置给药组及对照组。最后一次给予试验药物的第2天，制作脾脏细胞，使用适宜的标记细胞进行测定。Ⅲ.Ⅱ.第2阶段免疫毒性试验的检查项目1.骨髓细胞的分类百分率：使用后肢骨骼。2.淋巴细胞亚群的检查：对于末梢血液以及脾脏的B淋巴细胞、T淋巴细胞、T淋巴细胞亚群和天然杀伤细胞（NK），使用对于适宜表面标记等具有特异性的抗体进行计数，并求出其组成比。也可以用流式细胞测量法进行检查。3.血液化验：进行血清蛋白质的电泳。4.免疫球蛋白的分类检查：最后一次给予试验药物的第2天，采集血样，制作血清，保存（根据需要可以冷冻）。采用酶标记免疫吸附测定法（ELISA）进行免疫球蛋白的分类（（IgM、IgG、IgA和IgE））水平的测定5.免疫组织的化验：对淋巴组织、肾脏（包括免疫复合物沉着）以及皮肤等的免疫组织进行化验。6,免疫功能的检查：（1）抗体生成的检查：见上所述。（2）天然杀伤细胞（NK）活性的检查：如上所述。（3）其他免疫功能的检查：可以适当增加由Mitogene等引起的淋巴细胞增殖反应、细胞障碍性T细胞的活性、血清补体、细胞因子的生长、巨噬细胞和多态型白细胞的吞噬活性、迟延型变态反应（注1）、宿主抗性、淋巴结反应（注1、注2）、瞬时型变态反应（注1）、自体抗体、尿蛋白以及其他的检查。（注1）将这些变态反应用作指标，讨论其抑制和亢进。（2）有时将自体免疫的激发活性作为指标。8免疫毒性试验的工作程序（此为用于说明的概述性参考资料，准确内容请见指导原则的原文）新型候补药物生物制品及应用生物技术的药品除外反复给药的毒性试验（表2-Ⅰ）脏器重量、血液检查及组织病理学检查增加末梢血液淋巴细胞亚群的检查以及脾脏免疫组织的化验（注1）异常情况第1阶段试验的免疫毒性试验（表2-Ⅱ）抗体生成脏器重量及其他必要的检测项目[任选项：天然杀伤细胞（NK）的活性]（注2）异常情况第2阶段试验的免疫毒性试验）（表2-Ⅲ的适宜试验系统）（注1）除去表-1第1项，表-1中的有关药物。（注2）断定反复给药毒性试验的免疫毒性有关检查项目和增加的检查项目明显出现异常，而且进行抗体生成试验的必要性很小的场合下，可以直接进行第2阶段试验。田生云译