细胞培训

2014.7.10研究生实验技能培训－细胞培养基本知识1•基本概念2•体外细胞培养类型•细胞获取渠道3•细胞培养的条件•细胞培养方法细胞培养技术cellculture选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术细胞系cellline培养物开始第一次传代培养后的细胞有限细胞系（FiniteCellLine）连续细胞系或无限细胞系（InfiniteCellLine）细胞株用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株原代培养直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养传代细胞培养的条件无菌条件生长条件检测条件冻存条件无菌室、超净台、常用培养器皿简介、常用培养器皿清洗消毒细胞的营养、细胞培养液细胞培养显微镜冻存管无菌条件1.无菌室•无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。•每天晚上紫外照射过夜，第二天早晨关闭紫外灯，打开排风机排除臭氧，半小时后关闭排风机，打开送风机，方可使用。•每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒•使用前开启柜内紫外灯照射10－30分，•预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。•使用完毕后，要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净。•还要定期用福尔马林熏蒸。2.生物安全柜（超净工作台）3.常用细胞培养器皿•细胞培养板•6孔，•12孔，•24孔，•48孔•96孔•细胞培养皿•35mm•60mm•100mm•150mm•离心管•15ml•50ml•细胞刮•滤器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。•玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、泡酸、清洗四个步骤•新的橡胶制品洗涤方法0.5MNaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用•消毒前包装常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔•在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进。4.常用培养器皿清洗消毒•细胞的营养–碳水化合物、氨基酸和脂类三大类–也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素•细胞培养液–水：新鲜配置的三蒸水或去离子水–平衡盐溶液•主要由无机盐和葡萄糖配制而成，作用为维持渗透压、缓冲和调节酸碱度•常用的缓冲液：生理盐水，PBS，Hanks液（常用于配制胰酶溶液）–pH调节液•碳酸氢钠液•Hepes缓冲液：是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂，通常使用浓度为10～15mM–消化液–抗生素溶液–培养基–血清细胞生长条件(1)蛋白酶溶液主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来，常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA溶液作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶(3)胶原酶溶液胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化液抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。•天然培养基：–血清–血浆–组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）•合成培养基：–根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。–包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物–目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、–另有无血清培养基、无蛋白培养基培养基•最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。•开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。•其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。•尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、K-562及KATO—III等细胞系的培养。•RPMI1640种类–RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）–RPMI—1640（A）无酚红（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）–RPMI—1640（含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）RPMI1640•是在MEM培养基的基础上研制的•与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。•高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。•DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。DMEM•认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。•配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。•配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。•所用器皿应严格消毒。•配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。干粉培养基的配制血清的使用•血清质量好坏是实验成败的关键•常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。•优质血清的标准透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。•血清的灭活（消除补体活性）56℃，30分钟。•血清的消毒过滤除菌。•FBS(fetalbovineserum)胎牛血清应取自剖腹产的胎牛•新牛血清取自出生24小时之内的新生牛•CS(calfserum)小牛血清取自出生10－30天的小牛•使用浓度：一般为5－20％，最常用是10％•HS(horseserum)指马血清•缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)•细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成•谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺。•L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。氨基酸无机盐•CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4•对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的细胞培养方法•细胞传代方法1•细胞计数方法2•细胞活力检测方法354•细胞冻存与复苏方法•细胞污染检测每代贴壁细胞的生长过程•游离期–悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。•吸附期–贴附底物，一般24小时内贴壁。•潜伏期–此时细胞有生长活动，基本无增殖。–细胞株潜伏期一般为6～24小时。•对数生长期–细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，–最适合进行实验研究。•停止期（平台期）–细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂–机制：接触抑制、密度依赖性1.细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.02％EDTA的胰蛋白酶液。首次传代注意事项•细胞生长密度不高时，不能急于传代•原代培养的贴壁细胞需控制消化时间•吹打已消化的细胞应减少机械损伤•首次传代时细胞接种数量要多一些•首次传代培养的pH应偏低些•小牛血清浓度可加大至15%～20%左右传代注意事项•接种数量为5×104～8×105个/ml传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。•培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。•如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。•计数结果以每毫升细胞数表示•细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同•血细胞计数器：手工计数细胞•Coulter计数仪：人工计数2.细胞计数方法细胞计数步骤•1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。•2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。•3、静置3分钟。•4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104注意：压线细胞只计左侧和上方的。镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。•细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比•由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。•复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。3.培养细胞活力测定细胞活力测定方法•台盼蓝法–活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。•流式细胞仪–细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。•四唑盐（MTT）比色法–四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；–MTT比色法的原理：•活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。•二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。•甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值。•细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。•细胞低温保存的关键：在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。4.细胞冻存和复苏冻存和复苏的原则：慢冻快融•慢冻程序4℃10分钟－20℃30分钟－80℃16-18小时(或隔夜)—液氮罐长期储存。细胞复苏方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？•冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/ml•融合瘤细胞则以5x106cells/ml为宜。•细胞污染的种类–细菌、真菌、支原体和病毒•污染源–无菌操作技术不当–操作室环境不佳–污染之血清–污染之细胞5.细胞培养的污染和检测洋葱佰克霍尔德菌污染洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。白色葡萄球菌污染细菌：最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。白色念珠菌感染其他真菌感染真菌：最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。支原体污染电镜照片（左图：煎蛋状；中间：单个快速运动小虫；右图：长梭形）支原体：黑色的，多形，培养液一般会浑浊。国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Si