琼脂糖凝胶电泳-配方与步骤

�RNA琼脂糖凝胶电泳：配制：1.0.5MEDTA（pH=8.0）：100ml：称取18.61gNa2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80mlddH2O剧烈搅拌，用NaOH调节PH值至8.0（约需2gNaOH）.高压灭菌，室温保存。2.50×TAEloadingbuffer:（Trisacetate-EDTAbuffer）电泳缓冲液组分：2MTris-乙酸；100mMEDTA（pH=8.0）500mL:称121.1gTrisbase（分子量121.14），加800mlddH2O溶解，加57.1ml乙酸和50ml0.5MEDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。3.1×TAEloadingbuffer:取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。4.100×Sybergreen：500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ulSybergreen原液混匀，4℃锡纸避光保存。注意：Sybergreen原液需稀释10000倍；6×DNAloadingbuffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。步骤：1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml):称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3.加样:样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul6×DNAloadingbuffer:10/6=1.7ul100×Sybergreen：0.1ulDEPC水：至10ul(注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（transUV）下观察拍照保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无