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稳态/瞬态荧光光谱仪（FLS980-STM）操作说明书FLS980-STM外观图FLS980-STM单-单光栅内部光路示意图一、仪器介绍1.FLS980稳态/瞬态荧光光谱仪具有两种功能1.1稳态测量：激发光谱(荧/磷光强度~激发波长)、发射光谱(荧/磷光强度~发射波长)、同步扫描谱(固定波长差）。1.2瞬态测量：磷光寿命(1us—10s)使用微秒闪光灯。荧光寿命(100ps~50us)使用纳秒闪光灯，激发波长200nm-400nm1.3量子产率测量：使用积分球1.4各向异性，选取偏振片适合各类液体和固体样品的测试。2.主要应用高分子和天然高分子自然荧光的研究溶液中大分子分子运动的研究固体高分子取向的研究高聚物光降解和光稳定的研究光敏化过程的研究3.主要性能指标光谱仪探测范围：光电倍增管，200－870nm荧光寿命测量范围：100ps－10s光源450w氙灯，us闪光灯，ns闪光灯二、仪器测试原理(SPC)时间相关单光子计数原理是FLS980测量荧光寿命的工作基础。时间相关单光子计数法(time－correlatedsinglephotoncounting)简称“单光子计数(SPC)法”，其基本原理是，脉冲光源激发样品后，样品发出荧光光子信号，每次脉冲后只记录某特定波长单个光子出现的时间t，经过多次计数，测得荧光光子出现的几率分布P(t)，此P(t)曲线就相当于激发停止后荧光强度随时间衰减的I(t)曲线。这好比一束光(许多光子)通过一个小孔形成的衍射图与单个光子一个一个地通过小孔长时间的累计可得完全相同的衍射图的原理是一样的。三、测量之前需要特别注意的事项1.在切换光源、修改设置或放样品之前必须把狭缝（Δλ）关到最小（0.01nm），否则会损坏光电倍增管！如果打开样品室盖子之后，Em1的SignalRate增加，请与工程师联系2.测量样品的瞬态性质之前，请用稳态测量对样品的稳态性质进行表征，了解样品的激发光谱和发射光谱及最佳激发波长和发射波长；3.用PMT检测时，必须等稳压电源CO1的温度示数在－20℃以下才可以开始采集数据；4.狭缝范围0.01～18nm，调节时注意不要超过其上限；四、稳态荧光光谱的测定(一)紫外可见区稳态荧光光谱的测定步骤1、打开PH1给主机及数据采集供电；2.、CO1开关给检测器制冷到－20℃；3、做稳态打开氙灯xe1电源开关，等到氙灯显示readytostart，4、做磷光打开us闪光灯此时不闪烁，闪烁靠软件控制，5、做荧光短寿命打开ns闪光灯nf920开关，要预热10分钟6.打开计算机，双击桌面上F980图标，进入工作站7、点击窗口左上角的按钮，进入SignalRate设置窗口，显示默认值，更改设置按回车键(Enter)或者点击Apply确认，再将Source设置为Xe1，检测器默认设置，然后点击Apply；8.打开样品室的盖子，放入待测样品，然后盖好；9.在SignalRate设置窗口内输入相应的ExcitationWavelength和Em1Wavelength值，逐渐加大Δλ，使Em1获得一个合适的SignalRate（注意：在设置后需要按下回车或者Apply按钮设置才真正生效，Em1的SignalRate千万不要超过20的6次方）；10.激发扫描Ex单击按钮，选择ExcitationScan，进入设置窗口，在Emission1栏内，将MonochromatorWavelength设置为待检测波长，Detector默认设置，然后在ExcitationScanParameters内设置波长扫描范围、扫描间隔（step）、停留时间（DwellTime）和扫描次数（NumberofScans），设置完毕后点击Start即开始测量，得到激发光谱11.发射扫描Em点击按钮，选择EmissionScan，进入设置窗口，在Excitation标签内，将MonochromatorWavelength设置为合适的激发波长，然后在EmissionScanParameters内设置波长扫描范围、扫描间隔（step）、停留时间（DwellTime）和扫描次数（NumberofScans），设置完毕后点击Start即开始测量，得到发射光谱(荧光光谱)；12同步扫描Synchronous设置界面(二)数据处理1.测量完成后，直接点击保存图标保存原始文件；2.数据处理的功能都在Data菜单下：Scale:将当前的谱图坐标乘以输入的数值显示出来Normalise：归一化，用此功能可以比较峰位是否相同SubtractBaseline：扣基线CropRange：设置横坐标显示范围Differentiate：显示微分曲线Integrate：积分Reverse：将横坐标刻度倒过来显示Correction：谱图校正3.谱图处理完了以后点击File，选择ExportASCII即可以转换成文本文件。五、荧光寿命（瞬态）的测量注：目前仪器的配置只能测量紫外可见区的荧光寿命，FLS980配有两个脉冲灯(纳秒和微秒灯)，一般情况下荧光强度在50微秒内衰减到零用纳秒灯，荧光寿命大于50微秒衰减到零用微秒灯，具体设置和步骤如下：(一)紫外可见荧光寿命(荧光强度在50-100ps微秒内衰减到零)测量步骤1.打开PH1，CO1，nF920开关预热10分钟；2.打开计算机，双击桌面上F980图标进入工作站；3.点击View菜单，选择nFLampSetup进入窗口点击SwitchLampOn，观察纳秒灯的频率，注意在此窗口不要更改设置，观察正常后关闭窗口。注意压力为0.42bar,如果发现频率不能稳定在40kHz，请清洗氢灯，如果压力不正确请检查气密性重新置换充入氢气，（置换氢气要反复15次吸气，充气充气压力不能大于1.5Bar，最后保持在0.42Bar）；4.点击软件窗口左上角的按钮，进入SignalRate设置窗口，先将ExcitationWavelength和Em1Wavelength处的Δλ均设置为0.01，按回车键(Enter)或者点击Apply，再将Source设置为nFLamp，Em1Detector为默认，然后点击Apply；5.打开样品室，放入样品，盖好盖子，输入样品的ExcitationWavelength和Em1Wavelength值，逐渐加大Δλ，使Em1获得一个合适的SignalRate(一般不超过2000)；stoprate是starrate的5%6.点击按钮，选择ManualLifetime，进入设置菜单，在Excitation栏内设置好激发波长和LightSource，在Emission1栏内设置好发射波长和Detector然后开始设置下部的LifetimeSample1菜单，在Rates标签内一边观察StopRate务必在2000以下，再在TimeRange标签内选择一个合适的TimeRange设置通常是实际寿命10倍Channels（1024）在StopConditionPeakcount设置10000根据样品情况选择一个合适的条件，设置好之后，点击New开始测试；7.对于寿命很短的样品，在样品测量完成后，要做仪器的衰减(即IRF)，液体样品用30％硅胶水溶液作散射体，固体样品用固体本身作散射体，在SignalRate设置窗口中将ExcitationWavelength和Em1Wavelength值都设置为ExcitationWavelength值，然后调整ifs使stoprate小于20008.点击按钮，选择ManualLifetime，进入设置菜单，将Live、IRF和Add选择框勾上，别的设置与样品一致，设置好之后，点击New开始测试；9.测量完成后，选择拟合范围，10先点击图标选择拟合范围11、点击Data菜单，选择ExponentialFit中的RconvolutionFit12、X2平方要小于1.313、T1就是寿命如图寿命4.15ns14.拟合完成后，保存拟合的文件，共三种类型的文件，原始文件，ASCⅡ文件和图片文件：直接点击保存可以保存原始文件，点击File选择ExportASCII即可以保存成文本文件；选择saveas，保存文件类型选择为WindowsMetaFile可以保存成图片格式(二)紫外可见荧光寿命(荧光强度大于50微秒才能衰减到零)测量步骤对于荧光强度大于50微秒才能衰减到零的样品，需要用到微秒灯，其设置和步骤如下：1.打开CO1，主机和nF900电源；2.打开计算机，双击桌面上F980图标进入工作站；3.点击Options菜单，选择HardwareConfiguration在Lamps栏中将SteadyStateLamp勾掉，再将MicrosecondFlashlamp勾上4.点击软件窗口左上角的按钮，进入SignalRate设置窗口，先将ExcitationWavelength和Em1Wavelength处的Δλ均设置为0.01，按回车键(Enter)或者点击Apply，再将Source设置为µFLamp，Em1Detector默认设置，然后点击Apply；5.打开样品室，放入样品，盖好盖子，输入样品的ExcitationWavelength和Em1Wavelength值，逐渐加大Δλ，使Em1获得一个合适的SignalRate2000-3000cps；6.点击按钮，选择ManualLifetime，进入设置菜单，在Excitation栏内设置好激发波长和LightSource，在Emission1栏内设置好发射波长和Detector，再在TimeRange标签内选择一个合适的TimeRange10倍寿命值和Channels例如1024，在StopCondition10000根据样品情况选择一个合适的条件，设置好之后，点击New开始测试；(三)数据处理1.测量完成后，点击保存将原始文件保存；2.点击“ZoomIn”按钮，然后在图上选取一个需要进行拟合的范围，在Data菜单下选择“ExponentialFit中的TailFit，在弹出的窗口内输入数值进行拟合，得到衰减寿命；X2平方要小于1.3T1就是寿命如图118us六、量子产率的测量1量子产率测量使用积分球，首先将积分球更换到样品室，积分球放到样品室需要卸掉两个透镜，样品有固体液体之分，以液体为例，首先确定已知样品激发发射波长，样品浓度要合适0.15—0.4ABS常用0.1ABS的浓度2点击软件窗口左上角的按钮，打开样品仓盖子和积分球盖子将空白液放到积分球里，积分球选择CUVETTE盖上盖子，选择激发波长跟发射波长一样值，为样品的激发波长，调整狭缝使EM1的值不要超过10的6次方3点击按钮设置发射波长扫描范围，注意发射波长起始值要小于激发波长10-20nm，终止值大于样品的发射峰波长，测量空白液的发射光谱保存为BLANK3取走空白液放入样品其他条件不变测量样品的发射光谱保存为SAMPLE4在软件菜单中选择QuantumYield如下图SampleEmision选择保存的sample，samplescatter选择保存的文件sample，ref.scatter选择保存的文件Blank，ref.emission选择保存的文件blank接着按NEXT选择散射和发射光范围，计算出量子产率七关机程序1.退出F980程序和关闭计算机；2.关闭所有硬件电源开关及相关设备电源。天美（中国）科学仪器有限公司王贵平