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沈健2015.7.10免疫印迹（Westernblot）定义和基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WB的实验基本流程主要内容1.收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)2.电泳(Electrophoresis)3.转膜(Transfer)4.封闭(Blocking)5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)7.蛋白检测(Detectionofproteins)一、收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)1.蛋白样品选择是否合适。(组织细胞的表达特异性)2.蛋白样品的处理时候合适。(刺激效果是否达到)3.蛋白样品的验证是否可靠。(包括浓度，样品有没有降解等)样品制备中用到的试剂甘油：主要起沉降作用，让你在上样的时候不飘到孔外。SDS：导致蛋白质变性，易于蛋白结合，形成易溶于水的复合物。β-mercaptoethanol：作为还原剂，打开二硫键，使蛋白质的四级或三级结构被破坏，使蛋白成为寡氨基酸链。以与二硫苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使用溴酚蓝：作为一种指示剂，成蓝色，只是我们样品跑胶的一种程度。公司相对应的产品蛋白定量系列编号名称规格价格BD0028BioepitopeRBicinchoninicAcidProteinAssayKit500次380元BD0029BioepitopeRBradfordProteinAssayKit500次150元蛋白提取编号名称规格价格BD0030NuclearandCytoplasmicExtractionKit50T580元BD0031RIPAtotalproteinextractionlysisbuffer100T280元电泳原理：在一定的电场强度下，让带电的蛋白分子在电场下通过三维网状结构的胶，由于蛋白分子的大小不同，质量不同，导致它的迁移率不同，最终跑胶介绍会呈现分子量的一个梯状条带，分子量大的跑的越慢。浓缩胶：浓度比较低（4%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上分离胶：浓度比较大（10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被拦住，所以能呈现分子量不同的梯度。MARK:已知分子量的几种蛋白混合物，用来判断不同位置出现的蛋白条带的大小。二、电泳(Electrophoresis)PAGE胶：是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及DMAP或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)的总量百分浓度（w/v）。蛋白分子量(kDa)凝胶浓度(%)4-402012-451510-7012.515-1001036-947.525-200857-2125不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度原则：高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。SDS-PAGE的实例120kDa90kDa50kDa34kDa26kDa20kDa三、转膜转膜原理：在一定的电场下，将胶里面的蛋白分子像印章一样转移到固相介质上。转膜条件：湿转（一般我们选择稳流）和半干转(电流根据胶的面积来定)。转膜介质：作为蛋白最终的转移介质载体，不同的介质有各自的特点。PVDF膜：聚偏二氟乙烯膜，使用需用甲醇泡，的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，可以重复使用。NC膜：硝酸纤维素膜，比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开，依靠疏水性相互作用结合。转膜效果：可以根据蛋白MARK的转膜情况，来简单判断你的转膜效果，一般选择一定的转膜条件，对不同分子量的蛋白的转膜效率是不一样的。膜的选择几种膜的特点：NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率：高高高背景：低较高低结合能力：80－110ug/cm2400ug/cm2125－200ug/cm2材料质地：干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性：无无有价格：价格较便宜便宜较贵使用范围0.45um：一般蛋白0.2um：分子量小于20kD蛋白0.1um：分子量小于7kD蛋白低浓度丽春红染色的实例四、封闭(Blocking)作用：用其他蛋白填满膜上无蛋白的部分空隙，以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。步骤：转膜完毕后，丽春红染色之后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的丽春红染液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。加入封闭液（5%脱脂奶粉），在水平摇床上缓缓摇动，室温封闭1-2小时。五、一抗孵育一抗孵育：用封闭液（或者3%BSA）将一抗适当稀释(1：500-3000)，将已封闭的膜用TBST洗过三次之后（次数和时间自己把握，一般5min，3次），置于一抗的溶液中，放在抗体孵育盒上，保鲜膜包裹好（防止抗体挥发和交叉污染），室温孵育1h或者4度过夜。注意：一抗可以回收，放4度保存，可以放置2-3d。对于室温孵育的一抗，可能回收效果不如4度孵育的。六、二抗孵育二抗孵育：用2%脱脂奶粉（TBST溶解）将二抗1：5000-10000稀释，将膜置抗体溶液中，室温缓缓摇动1-2小时。再用TBST振摇洗3次，每次5分钟。BS10903GoatAnti-HumanIgG(H+L)HRPGoat100ul￥650BS30503RabbitAnti-GoatIgG(H+L)HRPRabbit100ul￥280BS12478GoatAnti-MouseIgG(H+L)HRPGoat100ul￥280BS13278GoatAnti-RabbitIgG(H+L)HRPGoat100ul￥280七、显色曝光显色：根据自己选择的二抗，选择合适的曝光方式一、HRP：1.化学发光底物(ECL)HRP辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。2.生色底物（DAB）二、AP：1.碱性磷酸酶检测系统（背景高，一般比HRP显色更灵敏）三、荧光标记的二抗选择合适的波长，进行显色（一般需要仪器）BLH01S050BiodlightWesternChemiluminescentHRPSubstrate超敏50ml￥470国内现货BLH01S100BiodlightWesternChemiluminescentHRPSubstrate超敏100ml￥780国内现货BLH02S050BiodlightECLChemiluminescentHRPSubstrate(Standard)敏感50ml￥220国内现货BLH02S100BiodlightECLChemiluminescentHRPSubstrate(Standard)敏感100ml￥320国内现货BLH02S500BiodlightECLChemiluminescentHRPSubstrate(Standard)敏感500ml￥980国内现货BS10011GoatAnti-MouseIgG(H+L)Dylight405Goat100ul￥420500ul￥1,291国内现货BS10012GoatAnti-RabbitIgG(H+L)Dylight405Goat100ul￥420500ul￥1,291国内现货BS10013RabbitAnti-GoatIgG(H+L)Dylight405Rabbit100ul￥420500ul￥1,291国内现货BS10014GoatAnti-RatIgG(H+L)Dylight405Goat100ul￥420500ul￥1,291国内现货BS10015GoatAnti-MouseIgG(H+L)Dylight488Goat100ul￥420500ul￥1,291国内现货BS10016DonkeyAnti-MouseIgG(H+L)Dylight488Donkey100ul￥650500ul￥2,000国内现货BS10017GoatAnti-RabbitIgG(H+L)Dylight488Goat100ul￥420500ul￥1,291国内现货