第十六章-色谱分析法概论

新乡医学院基础医学院第十六章色谱分析法概论(Introductionofchromatography)主讲:袁建梅E-mail:[e-mail]白酒分析毒韭菜有机磷（甲胺磷、毒死蜱、敌百虫、敌敌畏、甲拌磷、久效磷、马拉硫磷、乐果、对硫磷等）高晓松新乡医学院基础医学院掌握色谱的流出曲线及有关概念，包括保留值，峰高，峰面积，色谱峰区域宽度，分离度掌握分配系数，保留因子定义以及两者关系掌握分配系数和保留因子与保留时间的关系掌握塔板理论和速率理论熟悉色谱过程，四类基本类型色谱的分离机制，固定相和流动相，影响保留行为的因素了解色谱法的分类及色谱法的发展新乡医学院基础医学院色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。新乡医学院基础医学院固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚动画新乡医学院基础医学院在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相（stationaryphase）;自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相(mobilephase);装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱(column)。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。新乡医学院基础医学院Tiselius,A.W.K.Martin,A.J.P.Synge,R.L.M.1948年Nobel化学奖1952年Nobel化学奖吸附色谱与电泳分配色谱新乡医学院基础医学院色谱学的重要作用•诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。•应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等。•药学（药物分析）：各国药典收载了许多色谱分析方法。中国药典二部，700多种纯度检查、定性鉴别或含量测定的色谱方法;中国药典一部，600多鉴别或含量测定的色谱方法。新乡医学院基础医学院国内色谱研究概况国家色谱中心新乡医学院基础医学院色谱法定义、实质和目的定义：根据各物质在两相中的分配系数（表示溶解或吸附的能力）不同而进行分离、分析的方法。实质：分离、分析技术目的：定性分析或定量分析新乡医学院基础医学院色谱法的特点优点：“三高”、“一快”、“一广”高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——10-11～10-13g，适于痕量分析分析速度快——几～几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍生化再色谱分离、分析新乡医学院基础医学院缺点：对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)色谱法的特点新乡医学院基础医学院一、色谱过程第一节色谱过程和基本原理色谱操作的基本过程：•装柱•进样•洗脱分离（色谱分离的核心和关键）•检测新乡医学院基础医学院•实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相和流动相。•色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。一、色谱过程新乡医学院基础医学院吸附色谱过程1.把含有A、B两组分的样品加到色谱柱顶端,A、B均被吸附到固定相上。2.用适当的流动相冲洗色谱柱，当流动相流过时,已被吸附在固定相上的两种组分又溶解于流动相中,而被解吸附,并随流动相向前移进。3.流动相中的组分遇到新吸附剂颗粒,又再次被吸附。4.随着流动相的不断冲洗,在色谱柱上不断地发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附……的过程。新乡医学院基础医学院•分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异•微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出。新乡医学院基础医学院二、色谱流出曲线和有关概念（一）色谱流出曲线和色谱峰1.色谱流出曲线：是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。新乡医学院基础医学院3.色谱峰(peak)：流出曲线上的突起部分。•峰高或峰面积（用于定量）•峰位（用于定性）•峰宽（用于衡量柱效）2.基线（baseline）：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线（仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线）。基线反映仪器(主要是检测器)的噪音随时间的变化。新乡医学院基础医学院正常色谱峰为对称形正态分布曲线，曲线有最高点，以此点的横坐标为中心，曲线对称地向两侧快速、单调下降。新乡医学院基础医学院对称因子正常峰（对称）非正常峰前延峰拖尾峰色谱峰ABAAWfhs2)(205.0——fs在0.95~1.05之间——fs小于0.95——fs大于1.054.对称因子（symmetryfactor；fs）图16-3对称因子的计算示意图新乡医学院基础医学院1.死时间（deadtime,t0)不被固定相吸附或溶解的物质（如空气、甲烷等）进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。信号进样t0即组分随流动相流经色谱柱所需要的时间。（二）保留值新乡医学院基础医学院2.保留时间(retentiontime,tR)：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间。信号进样tR定距洗脱（展开）：使所有组分都被洗脱通过一定长度的色谱柱，记录各组分需要的时间。定时洗脱（展开）：记录组分在同一展开时间内的迁移距离。新乡医学院基础医学院3.调整保留时间(adjustedretentiontime,tR´)某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR´=tRt0tR´实际上是组分在固定相中保留的总时间。调整保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此有时用保留体积来表示保留值。信号进样tRt0tR´新乡医学院基础医学院4.死体积(deadvolume,V0)•柱管内固定相颗粒间间隙、进样器至色谱柱间导管的容积、柱出口导管及检测器内腔容积的总和。•死体积可由死时间与流动相流速Fc（cm3·min-1）计算。V0=t0Fc新乡医学院基础医学院5.保留体积(retentionvolume,VR)指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。对于正常峰，该组分的1/2量被洗脱出色谱柱时所消耗的流动相体积为保留体积。保留时间与保留体积关系：VR=tRFc6.调整保留体积(adjustedretentionvolume,VR)某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。色谱定性参数之一。VR=VRV0=tRFc新乡医学院基础医学院7.相对保留值（relativeretention,r2,1）某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。''''1,21212RRRRVVttr新乡医学院基础医学院8.保留指数（retentionindex,I）对于气相色谱，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，也就是以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数（retentionindex），又称Kovats指数。新乡医学院基础医学院式中：Ix为待测组分的保留指数，z与z+n为正构烷烃对的碳原子数。n可为1、2…..，通常为1。人为规定正己烷、正庚烷及正辛烷等的保留指数分别为600、700及800，其它类推。且多数同系物每增加一个CH2，保留指数约增加100，较少例外。)()()()(lglglglg100zRnzRzRxRxttttnZI新乡医学院基础医学院例：在ApiezolL色谱柱上，柱温100℃，用正庚烷及正辛烷为参考物质对，测定乙酸正丁酯的保留指数。测定结果：t0=30.0s，正庚烷的tR=204.0s，乙酸正丁酯的tR=340.0s，正辛烷tR=403.4s，求乙酸正丁酯的保留指数。6.775]0.174lg4.373lg0.174lg0.310lg17[100xI说明乙酸正丁酯在ApiezolL柱上的保留行为相当于7.756个碳原子正构烷烃的保留行为。新乡医学院基础医学院2、峰面积（peakarea）组分色谱曲线与基线间包围的面积。(三）色谱峰高和峰面积1、峰高（peakheight）组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。信号进样空气峰色谱峰ha新乡医学院基础医学院（四）色谱峰区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率，是色谱柱柱效参数。1.标准差():σ为正态分布曲线上两拐点间距离之半。即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。新乡医学院基础医学院2.半峰宽(peakwidthathalfheight；W1/2或Y1/2)：峰高一半处的峰宽度称为半峰宽，又称为半腰宽及半宽度等。W1/2=2.355σ3.峰宽(peakwidth，W)：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽，或称基线宽度，也可用Y表示。W=4σ或W=l.699W1/2W1/2与W都是由σ派生而来的，除用它们衡量柱效外，还用它们计算峰面积。新乡医学院基础医学院色谱峰区域宽度新乡医学院基础医学院（五）分离度（resolution，R）分离度：也称为分辨率或分辨度，它是指相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比：212112)(22/)(12WWttWWttRRRRR新乡医学院基础医学院设色谱峰为正常峰，且W1≈W2=4σ。若R=l，峰尖距(ΔtR)为4σ，此种分离状态称为4σ分离，峰基略有重叠，裸露峰面积≥95.4%(tR±2σ)。若R=1.5，峰尖距为6σ，称为6σ分离，两峰完全分开，裸露面积≥99.7%(tR±3σ)。在作定量分析时，为了能获得较好的精密度与准确度，应使R≥l.5。R值越大，表明相邻两组分分离越好，但分析时间会相应增加。新乡医学院基础医学院R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min新乡医学院基础医学院a.色谱峰个数判断试样中所含组分的最少数b.色谱保留值定性c.色谱峰面积或峰高定量A=KCd.保留值与区域宽度评价柱分离效能依据e.两峰间距评价两组分能否分离色谱图的信息新乡医学院基础医学院1.分配系数K（distributioncoefficient）定义：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值。K=cs/cm（一）分配系数K和保留因子k三、分配系数与色谱分离K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压的变化而变化。它是分配色谱中的重要参数。新乡医学院基础医学院分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组分在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K新乡医学院基础医学院2.保留因子k（capacityfactor；k）保留因子又称分配比、容量因子，它是指在一定温度和压力下，达到分配达平衡时，组分在固定相和流动相中的质量比。k=ms/mmk值也决定于组分及两相的性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。k=ms/mm=csVS/cmVm新乡医学院基础医学院3.