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高效液相色谱仪操作步骤：1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。7)．设计走样方法。点击file，选取selectusersandmethods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。10)．填写登记本，由负责人签字。高效液相色谱仪使用注意事项：1、泵正常工作时，在流动相和流速不变的前提下柱压应该是稳定的，当然在换流动相时压力变化是正常的，正常情况下如果柱压升高基本上都是由色谱柱使用时间长引起的（只有更换色谱柱），如果正常情况下压力突然降低有可能是（1）接头处有漏液的地方，采取的方法是有滤纸检查，如有漏液的地方用扳手拧紧即可。如果没有漏液则可能是（2）白色的管子里面有气泡从而导致流动相进不到泵里面去，采取的方法是排气泡排气时：先STOP停泵—打开排气阀—按PURGE（快冲）键—等气泡排完后先STOP停泵—拧紧排气阀，其先后步骤不要搞反了。2、泵正常工作时最高压力最好不要超过200KG，所以打开泵以后可以将泵的最大压力调到200KG，这样如果压力超过上限则会自动报警停机，流速最好不用超过1ML/MIN，如果使用时压力超过200KG，建议将流速调低点以降低压力（在色谱柱正常的情况下），如果是因为色谱柱长时间使用造成压力升高则建议更换色谱柱（因为色谱属于耗材长时间使用就需要更换，更换的主要依据色谱柱出峰不正常或者柱压力过高）。3、泵正常工作时平均每15天左右向注油孔加润滑油2~3滴。4、流动相里面如果有盐或酸类，做完实验后要先用95%二次蒸馏水与5%甲醇洗色谱柱40分钟左右，然后用纯甲醇洗30分钟左右才可以关机。第二天如果继续做实验流动相里面仍旧有盐或酸类，最好先用95%二次蒸馏水与5%甲醇过度20分钟，再用流动相。如果流动相里面只有甲醇，水，乙腈。做完实验后就不用95%二次蒸馏水5%甲醇冲洗，可直接用纯甲醇洗30分钟即可关机。5、C18色谱柱的耐酸PH值范围3—8使用时不要超出。6、仪器长期不用时一定要将滤头泡在甲醇里半月开机一次，如果开机时泵抽不上液可以打开排气阀按PURGE快冲。7、调反压器时要注意等液体流出来以后才能调一般调8—10KG，比如现在泵显示屏显示柱压50KG那再增加10KG显示屏上显示柱压60KG然后拧紧锁紧螺母。8、色谱仪关机顺序：清洗液路时可以把检测器直接关机，清洗结束后先按STOP让泵停止后在关电源不允许直接关机。