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实验模式动物—斑马鱼神经生物学系陆巍UseZebrafishASAModelOrganism报告内容•斑马鱼概况•斑马鱼作为模式生物的优点•斑马鱼的研究现状•本实验室斑马鱼的研究工作概况•70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被详细研究：在位于Eugene的俄勒冈大学，CharlesKimmel及其同事开始将斑马鱼作为研究发育的动物模型，并探索其作用。第一部分斑马鱼信息：•ChristianeNüsslein-Volhard•1995诺贝尔奖获得者wasabletoidentifyandclassifyasmallnumberofgenesthatareofkeyimportanceindeterminingthebodyplanandtheformationofbodysegments,turnedeyestofishandfindawiderangeofmutationsWolfgangDriever国内发展概况•始于4、5年前•南北两个中心北方服务中心依托于北京大学和清华大学，侧重于自创、收集和提供与早期胚胎发育、心血管发育和疾病相关的转基因品系和突变体库;南方服务中心依托于中国科学院上海生命科学研究院，侧重于自创、收集和提供与神经系统发育、血液发生、免疫系统发育和疾病相关的斑马鱼转基因品系和突变体库。•主要集中在重点高校及研究所“建立斑马鱼模式动物平台”被列入2006年国家重大发展研究计划•在2006年国家重大科学研究计划中，设立“发育研究的模式动物平台”项目。在规划中指出“依托现有的斑马鱼研究设施，完善共享的斑马鱼资源和技术平台，建立与发育、生殖研究相关的突变体库，完善相关研究技术，为国内同行提供资源和技术支持”。斑马鱼基本特性•产于热带印度，孟加拉国。•成鱼体长4～6厘米。体呈纺锤形。雌雄易区分。•性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。•属卵生鱼类，4月龄进入性成熟期。繁殖期约7天左右。产卵量高，繁殖力很强。•体外受精，胚胎透明，在24小时内就可发育成形，2~3天孵出仔鱼。♀♂斑马鱼的繁殖斑马鱼胚胎早期发育图谱PascalHaffteretal.Development,1996,123,1-36Zebrafish:Development能发荧光的热带斑马鱼普通热带斑马鱼是不发荧光的斑马鱼作为模式动物的优点WhyFish?•酵母菌yeast•蠕虫worm(Caenorhabditiselegans)•果蝇fruitfly(Drosophila)•鱼---斑马鱼zebrafish(Daniorerio)•蛙和鸡frogandChicken•鼠mouse几种最常用的模式动物(ModelOrganism)第二部分Saccharomycescerevisiae酿酒酵母真菌界的单细胞真核生物，有16个染色体它的全基因组已在1996年测定。细胞数目一定：成虫细胞数目只有959个，其中包括302个神经元；有6条染色体，全基因组于1998年测定，长9.7Mb。Caenorhabditiselegans线虫Drosophilamelanogaster果蝇繁殖很快、容易诱发变异的小昆虫。总长达1.8亿核苷酸。Musmusculus小鼠基因组大小与人类相近，约30亿个核苷酸对，有19条染色体。•“Formorethanadecade,vertebratedevelopmentalbiologistshavewatchedwithfascinationasthemysteriesofearlyembryonicdevelopmentwereunraveledinthefruitflyDrosophila……,NoneofestablishedvertebratemodelshareDrosophila’svirtuesofbreedingprolificallyandproducingreadilyobservableembryos…”Science264,1994斑马鱼作为模式动物的优点WhyFish?•Thescientificvalueofthezebrafishliesinitspositionontheevolutionaryladder.Asavertebrate,thezebrafishisseveralrungsclosertohumansthanarefruitflies(Drosophila)orworms(Caenorhabditiselegans),yetthefishisalsomuchmoremalleablethanmostmammaliananimalmodels.•hardiness,smallsize,andbrieflifespan•zebrafisheggsaretransparent——allowingdirectvisualizationoftheembryo.•Asinglefishlayshundredsofeggsatatime,providingampleresourcesfor“forwardgeneticscreens”WhyFish?CurrentResearchonZebrafish•发育Development•再生Regeneration•疾病Disease•在体药物研究Invivodrugdiscovery第三部分chokh/rx3基因突变导致的眼睛缺失发育EMBOreports4,894–899(2003)chokh基因突变的恢复EMBOreports4,894–899(2003)斑马鱼眼部突变分类SCIENCEVOL29518JANUARY2002突变导致的异常SCIENCEVOL29518JANUARY2002心血管系统发育DevelopmentofZebrafishVascularSystemNatureMedicine,1995DevelopmentofZebrafishVascularSystem28hours1.5days2days2.5days3days3.5days4.5days5days6days7days斑马鱼的骨骼发育发育缺少chordin表达的斑马鱼的BMP蛋白水平异常，鳍和尾部骨架也异常—注射chordinmRNA后可恢复。因此研究者使用斑马鱼的这项特性来进行基因筛查，以确定脊椎动物骨骼形成的调节机制。—RikDerynckNatureGenetics,1999Finandskeletaldefectsofdintt250homozygousmutantsnaturegenetics•volume23•december1999器官发生:心脏和血液形成•大多数脊椎动物的器官形状相似，因此，斑马鱼器官形成的有关基因也有可能与人类相似。发育SCIENCEVOL29518JANUARY2002器官形成模式图解脊椎动物器官形成比较SCIENCEVOL29518JANUARY2002影响心脏各阶段发育的基因突变影响血液各阶段发育的基因突变SCIENCEVOL29518JANUARY2002突变对心脏发育的影响Themutantmilesapartaffectsthedevelopingheart(mil,arrow).Theclochemutanthasnobloodorendothelium.突触形成的在体影像观察Synaptogenesisimagedinvivo突触发生的活体影像观察SynaptogenesisimagedinvivomiRNAexpressioninzebrafishembryonicdevelopmentScience,2005斑马鱼的心脏再生HeartRegenerationinZebrafish•斑马鱼的Mps1mitoticcheckpointkinase是一个至关重要的细胞周期调节因子，如发生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分子机制方面起重要作用。再生13DECEMBER2002VOL298SCIENCE心脏切除后心室肌的再生Regenerationofventricularmyocardiumintheresectedzebrafishheart心脏修复伴随心肌细胞再生Cardiomyocyteproliferationaccompanieszebrafishheartregeneration无疤痕修复需要心肌细胞增殖Cardiomyocyteproliferationisrequiredforscarlessregeneration使用斑马鱼进行人类疾病的研究•大规模的基因筛查已经取得了巨大的成就，确定了早期发育中的五百多个突变表现型。许多基因筛查中确定的斑马鱼的突变表型，为人类相应的病理生理学过程的研究提供了有效的途径。人类疾病模型•癌症Cancer•造血紊乱Hematopoieticdisorders•心血管疾病Cardiovasculardisorders•肾功能紊乱Kidneydisorders•其他器官疾病Otherorgans疾病模型1：癌症疾病•鱼类的癌症发生很常见，这一现象可能与水源中的致癌物有关。而鱼类所有系统中均能发生各种良性和恶性肿瘤的特性，在组织学特性上和人类肿瘤很相似。•人类基因组序列与即将完成的斑马鱼的基因序列的差异可用来证明细胞周期基因、肿瘤抑制基因及致癌基因的保守性。人类和斑马鱼胆管癌的组织学相似性CANCERCELL:APRIL2002人类和斑马鱼腺癌的组织学相似性NATUREREVIEWSCancer2003,3:1-7斑马鱼体系复制癌症模型的优点•快速基因筛查可针对这些高度保守的癌症通路•一旦发现癌症有关变异，可通过增强/抑制性筛查确定相互影响的基因•斑马鱼系统易于进行化学遗传性筛查影响癌症生物学研究的斑马鱼体系的特性•ForwardGenetics:makingamutationandthenfindthegene;includingENUmutagenesis,insertionalmutagenesis•ReverseGenetics:includingtargetlesiondetection;transgenesis;lineagetracingwithfluorescentproteins.疾病模型2：肾功能紊乱•斑马鱼肾脏发育和功能的许多方面与高级脊椎动物类似，因此提供了简单易理解的研究体系。已确定十八个隐性突变影响了斑马鱼原肾的发育，主要是肾小球和管囊的形成。•已证明几种突变与人类常染色体显性多囊肾疾病(ADPKD)有关。疾病模型3:贫血SirmutanterythrocyteshaveadefectinhaemoglobinproductionGrx5isresponsibleforthesirphenotype斑马鱼模型的特殊应用•StudiesofMusculoskeletalandSkinDevelopmentalDiseases•ZebrafishandCancerResearch•EyeDevelopmentandDisease•KidneyDevelopmentandDisease•CardiovascularandOtherOrganogenesisinZebrafish•ResearchonAging•ChildHealthandHumanDevelopment•Hematopoiesis•ResearchonEarMorphogenesisandHearingDisorders•DevelopmentalToxicologyinZebrafish•GenomeResearch•NeurogenesisandNeurologicalDisorders•EarlyDevelopmentalProgramsintheZe