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不染色标本检查法：是将细菌标本不经染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌的形态及运动状况的一种检查方法。主要用于观察细菌的动力。常用方法：1、悬滴法：观察自然状态下需氧菌和兼性厌氧菌的动力。2、压滴法：观察需氧菌和兼性厌氧菌的动力。按电离后染料离子的性质分类：（1）、碱性染料：此类染料电离时，染料离子带正电荷。如美兰。（2）、酸性染料：酸性染料电离时，染料离子带负电荷。如伊红。细菌的常用染色法：革兰染色、抗酸染色、荧光染色、鞭毛染色、荚膜染色。革兰氏染色法：【原理】（1）革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。（2）革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。（3）革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。【步骤】：涂片→固定→（媒染）→染色→（脱色）→（复染）。【结果】:紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌。革兰氏染色的三个原理，操作步骤与临床意义:1、原理（1）渗透学说：革兰阳性菌细胞壁结构较紧密，肽聚糖层厚，含脂质少，脱色时乙醇不易渗入，反而使细胞壁脱水，通透性下降，胞内结晶紫与碘的复合物不易渗出。格兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层薄，含脂质多，易被乙醇溶解，是细胞壁通透性增加，胞内结晶紫与碘的复合物易被乙醇溶解溢出而被脱色。【主要学说——细胞壁结构学说：G+菌和G-菌的细胞壁成分差异大，对脱色剂的反应不同】（2）化学学说：革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐可与结晶紫、碘牢固结合，而不易被乙醇脱色。革兰阴性菌内所含核糖核酸镁盐少，故易被脱色。（3）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pH2~3）比格兰阴性菌（pH4~5）低，在相同pH的条件下，革兰阳性菌比格兰阴性菌所带的负电荷多，与带正电荷的碱性染料结合较牢固，而不易脱色。2、操作步骤：①细菌涂片、干燥，经火焰固定（菌膜1cmX1cm）②结晶紫染色1min，水洗甩干③加碘液媒染1min，水洗甩干④加95%乙醇脱色30s，水洗甩干⑤用稀释复红或沙黄复染30s，水洗吸干后镜检3、临床意义：①鉴别细菌②选择治疗用药③与细菌致病性有关抗酸染色：【原理】分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。【结果】：未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌,脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。发色团：分子结构的某些基团吸收某种波长的光，而不吸收另外波长的光，从而使人觉得好像这一物质发出颜色似的，因此把这些基团称为发色基团/发色团。助色基：带有“色基”的苯衍生物叫“色原”或“色原物”。“色原”虽有色，但不一定能和被染物结合而着色，常需在染料分子中加上一个能电离的基团，使其能生成盐类而与被染物结合着色。这种结合在色原物上、能电离的化学基团称“【助色基】”或“【助色团】”。细菌的生化反应：是指利用生物化学的原理，来测定细菌对各种物质的代谢能力、代谢途径、代谢方式以及代谢产物的不同，从而对细菌进行鉴别鉴定的方法。碳水化合物的代谢试验：糖醇类发酵试验；葡萄糖氧化/发酵试验（O/F）；甲基红试验（MR）；V—P试验；β-半乳糖苷酶试验（ONPG）；七叶苷水解试验。蛋白质和氨基酸的代谢试验：吲哚（靛基质）试验；硫化氢试验；尿素分解试验；苯丙氨酸脱氨酶试验；氨基酸脱羧酶试验；明胶液化试验。碳源和氮源利用试验：枸橼酸盐利用试验；丙二酸盐利用试验。各种酶类试验：氧化酶试验；过氧化氢酶试验（触酶试验）；硝酸盐还原试验；脂酶试验；卵磷脂酶试验；DNA酶试验；凝固酶试验；CAMP试验；胆汁溶菌试验。抑菌试验：O/129抑菌试验；杆菌肽试验；奥普托欣试验(Optpchin)。IMViC试验：I——吲哚试验M——甲基红试验V——V-P试验C——枸橼酸盐试验糖（醇、苷）类发酵试验：【原理】各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，并且细菌对糖类分解后产生不同种类和数量的酸类或CO2，可根据此特点来鉴别细菌。【方法】根据待检菌的鉴别要求选用合适的含有糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷、菊糖等）的培养基，将待检菌接种经培养后观察结果。【结果】若分解糖类产酸，培养基中的指示剂呈酸性反应；产气的细菌能使半固体培养基内或液体培养基中倒置的小管内出现气泡，固体培养基则出现裂隙；不分解糖类，培养基则无颜色等变化。【应用】是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别用于肠杆菌科细菌的鉴定。如伤寒沙门菌分解葡萄糖产甲酸，而甲型副伤寒沙门菌分解葡萄糖产甲酸外还产生CO2用此可区别二者。葡萄糖氧化/发酵试验（O/F）：【原理】细菌利用糖的方式有氧化和发酵两种类型。其中在分解过程中必须由氧分子参加的为氧化型；能进行无氧酵解的为发酵型，发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的为产碱型。O/F试验就是利用两管同样的含唯一一种可分解糖——葡萄糖的培养基，一管处于有氧状态；另一管造成厌氧环境，接种细菌并经培养后，分别观察细菌在有氧和无氧环境中分解葡萄糖的能力，从而确定细菌对糖的分解类型的一类试验。【培养基】通常所用的培养基是两管含葡萄糖的半固体琼脂，其中一管加有1ml的液体石蜡（隔绝空气），称“F管”；另一管不加石蜡，称“O管”）。培养基中含有溴麝香草酚兰，由于培养基在正常状态下呈中性，故正常状态呈绿色。【结果】1、O管：黄色；F管：绿色，氧化型。2、O管：黄色；F管：黄色，发酵型。【意义】（1）、用于葡萄球菌属与微球菌属的鉴别；（2）、用于肠杆菌科、弧菌科与非发酵菌的鉴别。β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）：【原理】有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻硝基酚，在很低浓度下也可检出。【方法】从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。【结果】菌悬液呈现黄色为阳性反应。一般在20～30min内显色。【应用】常用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定。如埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属等为阳性；沙门菌属、变形杆菌属等为阴性。七叶苷水解试验：【原理】七叶苷可被细菌分解为葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的起反应，形成黑色化合物，使培养基变黑。【方法】将待检菌接种到七叶苷培养基上，培养后观察。【结果】变黑色或棕黑色者为阳性，不变色为阴性。【应用】主要用于D群链球菌（阳性）和其他链球菌（阴性）的鉴别。也可用于肠杆菌科、其他革兰阴性菌及厌氧菌的鉴别。甲基红试验（MR）：【原理】不同的细菌分解葡萄糖后的代谢产物是不同的，如大肠埃希氏菌分解葡萄糖后产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解为甲、乙、丙、丁酸、乳酸、琥珀酸等各种酸类物质，而使培养基的ph值下降，当pH值下降至pH4.5以下时，加入甲基红指示剂，培养基呈现红色，此为阳性反应。若细菌分解糖后产酸量较少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醛、气体或水）培养基的pH值则保持在6.2以上，此时加入MR指示基，培养基呈桔黄色，此为阴性反应。【培养基】葡萄糖磷酸盐蛋白胨水。【结果】培养基呈红色者为阳性；桔黄色为阴性。【意义】主要用于肠杆菌科各属、种间的鉴别。V—P试验：【原理】测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。【结果】红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。【应用】主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。吲哚（靛基质）试验：【原理】：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。【培养基】：蛋白胨水培养基。【结果】：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。【应用】：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。硫化氢试验：【原理】某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子，可形成黑色的硫化铅和硫化亚铁沉淀。【培养基】：醋酸铅培养基。【结果】：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。【意义】：主要用于肠杆菌科的属种鉴定。尿素分解试验：【原理】：有些细菌能产生尿素酶，能将培养基中的尿素分解产生大量的胺，从而使培养基变碱并使酚红指示剂变红。【培养基】：尿素培养基。【结果】：培养基变红为阳性，不变色为阴性【意义】：主要用于肠杆菌科的属种间鉴别。苯丙氨酸脱氨酶试验：【原理】：有些细菌如变形杆菌属可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基后生成苯丙酮酸，后者与三氯化铁试剂作用，可形成一种不稳定的绿色化合物。从而使苯丙氨酸斜面变为绿色。【培养基与试剂】：培养基：苯丙氨酸琼脂斜面；试剂：10%FeCL3溶液。【注意事项】：结果必须立即观察，若延长时间，则绿色会消退。【用途】：主要用于肠杆菌科的初步分群。氨基酸脱羧酶试验：【原理】：本试验是测定细菌能否产生氨基酸脱羧酶以及氨基酸脱羧酶种类的一种试验。临床上常用的氨基酸脱羧酶试验共有三种：即赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验和精氨酸脱羧酶试验。产物基本相同，即都产生胺和CO2。由于胺是碱性物质，大量胺的产生使培养基的Ph值升高（7.0以上），从而使培养基中的溴甲酚紫指示剂显紫色。【培养基】：1、试验管：含0.1%葡萄糖；0.5%相应氨基酸；溴甲酚紫指示剂。2、对照管：除不含相应的氨基酸外，余均同试验管。3、两管均应加入液体石蜡或矿物油，以隔绝空气。【结果】：孵育后，对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性；若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，重新做试验。【意义】：主要用于肠杆菌科的属、种鉴定。枸橼酸盐利用试验：【原理】：本试验就是测定细菌能否利用枸橼酸盐作为唯一的碳源和能否利用磷酸二氢铵做为唯一氮源的一种试验。当把细菌接种到只含有枸橼酸盐和磷酸二氢铵这种唯一碳源和氮源的培养基中时，若细菌不能利用这种唯一的碳源和氮源，则细菌不能生长；若细菌能以此作为唯一的碳、氮源，则能利用其生长繁殖，并将枸橼酸盐转变为碳酸盐，同时将磷酸二氢铵分解成磷酸盐和NH3。由于碳酸盐和NH3均属碱性，故大量产生后可使培养基变碱，使溴麝香草酚兰指示剂变蓝色。【培养基】：枸橼酸盐斜面培养基。【结果】若培养基斜面由绿色变为蓝色，则为阳性；若培养基斜面仍为绿色为阴性。【意义】：主要用于肠杆菌科的属、种鉴别。氧化酶试验：【原理】：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。【结果】：取一洁净滤纸片，沾取被检菌的菌落少许，加氧化酶试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而变为深红色，并于10～30分钟内变为紫黑色；阴性者颜色无明显改变。【质控菌】：阳性菌株：铜绿假单胞菌：阴性菌株：大肠埃希氏菌。【意义】：（1）、用于奈瑟氏菌属的鉴定（均阳性）。（2）、用于肠杆菌科与其它相似菌科的鉴别。【注意事项】：）（1）、操作过程中应避免接触含铁物质，否则易出现假阳性；（2）、若菌落本身呈红色，试验结果无法判断时，可于试验时在纸片上滴加氧化酶试剂后，再滴加一滴10%α—萘酚，此时菌落变为蓝色为阳性；菌落仍为红色为阴性。触媒试验（过氧化氢酶试验）：【原理】具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。【试剂】：3%过氧化氢溶液。【方法】取菌落