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荧光技术原理及应用陶亮中山医学院药理学教研室1光的基本知识一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式光的波长越长，光子的能量越小光波波长γ射线10-5～10-3nMX线10-4～0.1nM远紫外10～20nM紫外200～400nM可见光400～760nM红外0.76～50μM远红外50～1000μM微波0.1～100cM无线电波1～100M2二.光的性质：粒子性——光子（光量子）波动性——光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动波长—光的颜色振幅—光的亮度波长振幅波长长（频率低）—光子能量小波长短（频率高）—光子能量大3三.光的吸收光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子所吸收。物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时，以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量——发射光。光的吸收具有选择性—一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收滤光片—吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过4（一）荧光—物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色三.荧光的基本知识52.荧光产生的原理6无论那种荧光，其发光机理是相同的由光激发的荧光—光致荧光由化学反应引起的荧光—化学荧光由X射线引起的荧光—X射线荧光由激光引起的荧光—激光荧光化学荧光在有生命的生物体中产生—生物发光73.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针)—能够产生荧光的化合物发射荧光的光量子数荧光效率=——————————吸收光的光量子数反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率—越大越好荧光素的荧光效率0.358斯托克斯位移（Stokesshift）•物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。•荧光素的发射波长总是大于其激发波长。•两者的差值—斯托克斯位移（Stokesshift）；—激发到发射过程中存在能量损失9hvEX—hvEM=荧光效率10利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光114.荧光素的性质（1）激发光波长和发射光波长荧光素激发光波长——近紫外区域，可见光区域发射光波长——可见光区域发射光波长激发光波长根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片12（2）激发光谱和发射光谱荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质激发光谱—荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱吸收光谱发射光谱—荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱13WavelengthExcitationSpectrumEmissionSpectrumλEXλEM14激发光谱和发射光谱的用途激发光谱—确定荧光素适宜的激发波长的依据发射光谱—确定荧光素检测波长的依据最大激发波长λEX最大发射波长λEM激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质—每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱15（3）荧光强度荧光强度——荧光素发射荧光的光量子数决定荧光素检测的灵敏度荧光素的荧光效率决定其荧光强度16（4）荧光寿命荧光寿命（激发态寿命）—电子在激发态的平均停留时间荧光寿命长—检测特异性和灵敏度高1718荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失——漂白（5）荧光漂白（6）自发荧光组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光19荧光染料的发展简史1838年Brewster首次描述了荧光现象1852年Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料）1903年Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片1911年Reicherl发明荧光显微镜1935年Haitinger将荧光物质用于固定的细胞和组织，活细胞染色新的荧光探针，新的检测技术不断出现荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究20常用的荧光染料（探针）一.细胞器荧光探针——能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的荧光物质。可用于固定和活细胞细胞器的染色线粒体荧光探针——JC-1,Rhodamine123溶酶体荧光探针——DAMP，NeutralRed内质网荧光探针——Dioc6(3),Dioc5（3）,Dioc16(3)高尔基体荧光探针——NBDCeramide,BODIPYCeramide21二.细胞骨架荧光探针F-肌动蛋白荧光探针—BONIPYFL,BONIPY558/568G-肌动蛋白荧光探针—DNaseI+荧光素AlexaFluor488OregonGreen488TexasRed微管蛋白荧光探针—秋水仙减+荧光素DAPIDCVJBis-ANS微管选择性紫杉醇探针—Flutax-2BODIPYFLPlaclitaxelBODIPY564/570Placlitaxel22三.研究钙调节和活性的荧光探针钙调蛋白荧光探针—钙的类似物三氯化忒PKC荧光探针—用BODIPY标记的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针钙离子荧光探针Quin-2-AMFura-2-AMFura-3-AM紫外光激活—可见光激活23三.核酸荧光探针能以非共价键与DNA/RNA结合，用于DNA/RNA的定性、定量分析胞膜透过性核酸荧光探针—用于细胞染色非透过性核酸荧光探针—用于DNA琼脂凝胶电泳EB和PIPO-PRO和BO-PROAADACMASYTOAOHoechstDAPI24四.其它荧光探针受体酶生长因子离子通道等等……25绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物Ca2+肠腔素蓝色荧光Aequoren+1.GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）GFP绿色荧光26GFP的特性与优点1.GFP的光谱特性—最大激发波长—460-490nm发射波长—500-550nmGFP的特性：2.GFP的分子量小（20kDa）—当与其它蛋白组成融合蛋白时，不影响结合蛋白的功能GFP的优点：1.可溶性蛋白，性质稳定2.荧光强，易加工到其它蛋白质序列上3.无进入细胞问题，标记可靠4.表达GFP融合物的细胞，可在生活状态下进行实验和检测5.对细胞无毒27GFP,CFP,BFP,YFP商品化质粒1.转基因动物:Greenmouse2.外源基因的报告基因:将外源基因与GFPDNA相连,可实时监测外源基因的表达.3.检测细胞能否表达某一基因:将待测基因的启动子与GFPDNA相连,可实时监测细胞能否表达兴趣基因.4.GFP-蛋白融合技术:将结构蛋白基因与GFPDNA相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成GFP的应用：28荧光检测仪器1.荧光分光光度计用于大容积样本（ul,ml)的测量292.荧光显微镜（激光共聚焦荧光显微镜）用于具有三维立体形状的样本（如细胞、组织切片等）的测量荧光显微镜激光共聚焦荧光显微镜303.流式细胞仪（FCM）对处在快速直线流动细胞状态中的细胞或生物颗粒进行快速定量分析和分选；用于把指定参数参量的细胞亚群从整群细胞中分选出来。314.小动物活体成像系统对荧光素标记的生物分子和细胞在整体水平进行检测32KCL诱导的细胞外Ca++内流测量KCLKCL活细胞内离子动态变化测量可变换波长的荧光分光光度计可变换波长的荧光显微镜激光共聚焦显微系统33