第五章--微生物的生长繁殖与生存

第五章微生物的生长繁殖与生存因子相关定义第一节微生物的生长繁殖第二节微生物的生存因子第三节其他不利环境因子对微生物的影响第四节微生物与微生物之间的关系第五节菌种的衰退、复壮和保藏相关定义生长：微生物利用营养物质，细胞物质的量增多，体积增大。繁殖：微生物细胞体积增大到一定程度时，细胞数目增多的过程。第一节微生物的生长繁殖微生物的生长规律微生物的连续培养生长曲线在实际中的应用微生物生长量的测定方法微生物的生长规律分批培养：将一定量的微生物接种在一个封闭的盛有一定量液体培养基的容器中，保持一定的温度、pH和溶解氧，一定时间后停止培养。同步生长：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态。获得细菌同步生长的方法：通过环境条件来诱导同步性，包括变换温度、光线、培养基等。通过物理方法随机地从不同步细菌群体中选择出同步的群体，选择性过滤、梯度离心。化学诱导物理诱导诱导法过滤法区带密度梯度离心法膜洗脱法筛选法同步培养法典型生长曲线定量描述非丝状单细胞微生物分批培养时,液体培养基中微生物群体生长规律的经典曲线。以时间为横坐标，细胞数目（或是对数）为纵坐标的曲线。生长曲线的制作：接种适温培养定时取样测定生长量将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作接种的培养基中细胞变化趋势菌种接种于培养基中后，细胞需要适应新的环境，因此细胞数目不增加；经过基础物质的积累，且因营养物质丰富，所以细胞迅速分裂，细胞数目急剧增加；细胞的繁殖导致营养物质不断减少，某一种营养物质不足时，有的细胞利用细胞内的累积物继续分裂，而会有一部分细胞因营养不足而死亡，表现为细胞数目不变；培养基中营养进一步匮乏，细胞不断裂解，细胞数目减少。延滞期：少量细胞接种到新培养基后的一段细胞数目不增加的适应期。其长短主要受微生物的接种龄、接种量和培养基成分的影响。对数期：细胞数以几何级数增长的一段时期。其时间长短主要受菌株种类、营养成分和营养物质浓度的影响。稳定期：新繁殖的细胞数目与衰亡的细胞数目相等的一段时期。衰亡期：细胞死亡数目超过新生的细胞数目的时期。死亡的细胞发生自溶。延滞期（lagphase）又称停滞期、适应期细菌数目不增长的时期。特点：生长速率常数等于零；细胞形态变大或增长；RNA尤其rRNA含量增加，合成代谢活跃；对外界不良条件敏感。影响延滞期的因素：1）接种龄；（对数期，则短；延滞期或衰亡期，则长；稳定期，居中。）2）接种量（负相关）3）培养基成分（丰富则延滞期短）指数期（exponentialphase）又称对数期以几何级数速度分裂的一段时期特点：生长速率常数R最大，则细胞每分裂一次所需要的代时G或原生质增加一倍所需时间最短；细胞进行平衡生长，各种组分最为均匀；细胞内酶系活跃，代谢旺盛。1）繁殖代数：n＝（lgx2－lgx1）/lg2=3.322(lgx2－lgx1)2)生长速率常数R＝n/(t2-t1)=3.322(lgx2－lgx1)/(t2-t1)3)代时（G）：G=1/R=(t2-t1)/3.322(lgx2－lgx1)影响因素：1）菌种；2）营养成分（营养丰富则代时短,指数期则短）3）营养物浓度（概念：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物称为生长限制因子）4）培养温度（适合温度）稳定期（stationaryphase）死亡细胞数目和新增殖细胞数目平衡。平衡后期，曲线有下降趋势。菌体产量与营养物貭的消耗间呈现一定的比例关系。生长产量常数Y＝（x－x0）/(C0-C)=（x－x0）/C0x：稳定期的干重；x0：刚接种时的细胞干重；C0：限制性营养物的最初浓度在稳定期，细胞开始贮存糖原、异染粒和脂肪等贮藏物，产芽孢，产次生代谢产物。可通过补料、调节pH、调整温度、流出产物等措施以延长稳定期累积更多的代谢产物。出现的原因：生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调；有害物质的累积；pH、氧化还原势等物质条件越来越不适宜。衰亡期（declinephase）死亡后自溶释放出一些产物如：氨基酸、转化酶、外肽酶、流出培养物。因此可以在这个时期收集细胞内溶物。一些细菌的代时菌名培养基培养温度代时E.coli（大肠杆菌）肉汤37℃17minE.coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶3716~18E.aerogenes组合3729~44B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶3766~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖25344~46Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合37792~93Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌）组合271200例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（t）后增加到49，000，000（b），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。微生物的连续培养又称开放式培养。包括两种形式：流进新鲜培养基；流出培养物恒浊器（生长密度）培养：通过控制培养液中细胞浓度即浊度来完成。恒化器培养：通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的。单批培养恒浊法恒化法单批培养连续培养时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如氨基酸、乳酸、乙醇等。装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高不同生长速率的菌体实验室为主恒浊器与恒化器的比较生长曲线在实际中的应用细菌生长曲线在污、废水微生物处理中的应用常规活性污泥法利用减速期/稳定期的微生物生物吸附法（生物膜法）利用稳定期的微生物高负荷活性污泥法利用对数期/减速期的微生物低负荷活性污泥利用衰亡期的微生物。延时曝气法：内源性呼吸阶段的微生物微生物生长量的测定方法测定微生物总数：计数器直接计数；比例计数法；比浊法测定活细菌数：平板菌落法（CFU）计数；液体稀释培养计数计算生长量：测细胞干重法；通过测细胞含氮量确定细胞浓度血球计数板法平板菌落计数法(CFU)最常用的活菌计数法。将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量。直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落数在30~300之间为报告依据。9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml×2×2×2液体稀释法对样品做10倍连续稀释，从适宜的3个连续稀释度中各取5ml试样，接种3组共9支装有培养液的试管中（每管接入1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查M.P.N.表（mostprobablenumber，最大可能数），根据样品稀释倍数就可计算处其中的活菌含量。9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml×3×3×31ml1ml1ml1ml首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物。如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。这种方法适合于细胞较大的微生物。液体稀释法2测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。测生长量的方法其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。第二节微生物的生存因子温度pH溶解氧氧化还原电位水活度渗透压温度：对于微生物而言，温度可分为适合生长温度、最高生长温度、最低生长温度根据微生物对温度的要求可以区分微生物为嗜冷微生物、嗜热微生物、嗜温微生物等pH（5－9）最适生长pH偏碱范围内的微生物称为嗜碱性微生物或是耐碱性微生物；偏酸范围内的微生物称为嗜酸微生物或是耐酸微生物培养基内中性成分：糖类―发酵氧化――→有机酸脂肪―水解――→有机酸蛋白质―脱羧――→胺类无机盐：NH3NO3-微生物pH值最低最适最高Thiobacillusthiooxidans氧化硫硫杆菌0.52.0~3.56.0Lactobacillusacidophilus嗜酸乳杆菌4.0~4.65.8~6.66.8Rhizobiumjaponicum大豆根瘤菌4.26.8~7.011.0Azotobacterchroococcum圆褐固氮4.57.4~7.69.0Nitrosomonassp.硝化单胞菌7.07.8~8.69.4Acetobacteraceti醋化醋杆菌4.0~4.55.4~6.37.0~8.0Staphylococcusaureus金黄葡球菌4.27.0~7.59.3Chlorobiumlimicola泥生绿菌6.06.87.0Thurmusaquaticus水生栖热菌6.07.5~7.89.5Aspergillusniger黑曲霉1.55.0~6.09.0一般放线菌5.07.0~8.010.0一般酵母菌3.05.0~6.08.0pH对微生物的影响：1）引起细胞膜电荷的变化，影响对营养物质的吸收2）影响胞内及胞外酶的活性培养基中pH调节的措施：外源调节:碱(NaOH或KOH)酸(H2SO4或HCl)内源调节:缓冲溶液;CaCO3溶解氧：根据对溶解氧的要求，可将微生物分为专性好氧微生物、兼性厌氧微生物、微好氧微生物、耐氧微生物及厌氧微生物。专性好氧微生物（strictaerobe）：环境中有足够氧才能生存O2作为最终氢受体，以呼吸方式产能。细胞含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶、过氧化氢酶兼性厌氧微生物（facaltativeaerobe）环境中有氧时，靠呼吸产能。环境中氧不足或是无氧时，借发酵或无氧呼吸产能。细胞中含SOD和过氧化氢酶。微好氧菌（microaerophilicbacteria）只能在较低的氧分压条件下生长的微生物。含SOD和过氧化氢酶。耐氧菌（aerotolerantanaerobe）有氧条件下进行厌氧生活，靠专性发酵获能量。含SOD、过氧化物酶，而无过氧化氢酶厌氧菌（anaerobe）严格生活在无氧条件下，靠发酵形式产能。O2可以抑制这一类微生物的生长溶解氧在细胞中能转化为过氧化氢及氧负离子自由基，均对细胞有害O2＋2H＋→H2O2O2+e→O2－好氧微生物及兼性厌氧微生物细胞中具有一定酶，可以转化过氧化物。O2－－SOD－－→H2O2－NADH过氧化物酶－→H2OH2O2－过氧化氢酶－→H2O＋O2而厌氧微生物细胞中无相应的酶，不能解除过氧化物的危害，因此必须生活在无氧条件下H2O+O22O2·+2H+O2+H2O22H2O12SOD好氧生物和耐氧细菌过氧化氢酶好氧生物过氧化物酶NADH2NAD耐氧菌氧化还原电位好氧微生物要求的Eh为＋300－＋400mV专性厌氧微生物要求的Eh为