第-六-章--微生物的生长及其控制..

食品微生物学南京农业大学食品科技学院南京农业大学食品院食品微生物组第六章微生物的生长及其控制第一节微生物生长的测定第二节微生物的群体生长规律第三节微生物的培养方法第四节影响食品中微生物生长的因素第五节食品中微生物控制的原理和方法南京农业大学食品院食品微生物组生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖南京农业大学食品院食品微生物组第一节微生物生长的测定单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的增加。微生物生长：微生物生长的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定南京农业大学食品院食品微生物组一、以数量变化对微生物生长情况进行测定1、培养平板计数法：广泛用于各种样品的检测方法：（1）涂布法（菌长在表面）（2）倾注法（菌长在表面和基内）优点：常用、较准确、可对不同种微生物做活菌计数。缺点：时间长、人为误差大，有机械损伤。南京农业大学食品院食品微生物组一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。南京农业大学食品院食品微生物组2、膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。南京农业大学食品院食品微生物组3、液体法将待测样品做系列稀释，培养后，根据没生长的最低稀释度和出现生长的最高稀释度，应用“或然率”理论，计算出样品单位体积中细胞的近似值。最高稀释度称为临界级数，从3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可靠的结果。南京农业大学食品院食品微生物组4、显微镜直接计数法1）常规方法：缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察取定容稀释的单细胞微生物(细菌)悬液放置在计数板上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供试样品的细胞数。南京农业大学食品院食品微生物组2）其它方法：将已知颗粒浓度的样品与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。比例计数：过滤计数：当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；活菌计数：采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数南京农业大学食品院食品微生物组（二）以生物量为指标测定微生物的生长1、比浊法根据在一定的浓度范围内，菌悬液的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度成反比。菌数越多，透光量越低。可使用光电比色计测定，通过测定菌悬液的光密度或透光率反映细胞的浓度。菌悬液浓度必须在107个/毫升以上。南京农业大学食品院食品微生物组2、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；南京农业大学食品院食品微生物组3、生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。常用于对微生物的快速鉴定与检测南京农业大学食品院食品微生物组第二节微生物的群体生长规律一、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映单细胞微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。南京农业大学食品院食品微生物组一、单细胞微生物的典型生长曲线根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，一条典型的生长曲线至少可以分为：迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期南京农业大学食品院食品微生物组迟缓期的特点：细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。1.迟缓期(Lagphase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。南京农业大学食品院食品微生物组迟缓期出现的原因：调整代谢在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量南京农业大学食品院食品微生物组对数生长期(Logphase)：又称指数生长期(Exponentialphase)，在生长曲线中，紧接着迟缓期的一段细胞数以几何级数增长的时期。对数生长期特点：平衡生长；酶系活跃、代谢旺盛；生长速率常数R最大、代时最短。是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。南京农业大学食品院食品微生物组对数生长期(Logphase)的重要参数：X2=2n.X1lgX2=lgX1＋nlg2（1）繁殖代数（n）n=（lgX2-lgX1）/lg2=3.322（lgX2-lgX1）（2）生长速率常数（R）R=n/t2-t1=3.322（lgX2-lgX1）/t2-t1（3）代时(G)G=1/R=t2-t1/3.322（lgX2-lgX1）南京农业大学食品院食品微生物组影响微生物增代时间（代时）的因素1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短；3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。南京农业大学食品院食品微生物组3.稳定生长期(Stationaryphase)：由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零。稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。南京农业大学食品院食品微生物组4.衰亡期(Decline或Deathphase)：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如抗生素等。在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。南京农业大学食品院食品微生物组二、连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。南京农业大学食品院食品微生物组控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速,使营养物质浓度保持恒定二、连续培养(Continousculture）连续培养装置示意图南京农业大学食品院食品微生物组概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率。(一）恒化连续培养南京农业大学食品院食品微生物组（二）恒浊连续培养概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：维持菌浓度不变。特点：基质过量，菌以最高速率生长；但工艺复杂，烦琐。在恒浊连续培养中装有浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并根据光电效应产生的电信号的强弱变化，自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。南京农业大学食品院食品微生物组连续培养的优点1、缩短发酵周期，提高设备的利用率；2、便于自控。降低动力消耗及劳动强度；3、产品均一。连续培养的缺点：易杂菌污染；菌种易退化南京农业大学食品院食品微生物组恒化培养和恒浊培养的比较装置控制对象生长限制因子培养液流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度无不恒定最高生长速率大量菌体或与菌体相平行的代谢产物生产为主恒化器培养液流速有恒定低于最高生长速率不同生长速率的菌体实验室为主南京农业大学食品院食品微生物组同步生长：运用同步培养技术，控制微生物生长，使之处于同一生长阶段并同时分裂。同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法。同步培养（物）：用同步培养法所得到的培养物。三、同步培养南京农业大学食品院食品微生物组同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。机械方法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法环境条件控制技术温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）获得同步生长的方法：南京农业大学食品院食品微生物组硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。南京农业大学食品院食品微生物组第三节微生物的培养方法1.少量培养→大规模培养2.浅盘培养→厚层固体或深层（液体）培养3.以固体培养为主→以液体培养为主4.静止式液体培养→通气搅拌式液体培养5.分批培养→连续培养→多级连续培养6.游离的微生物细胞培养→利用固定化细胞培养7.单一微生物培养→混合微生物培养8.野生菌种→变异菌株、“工程菌”微生物培养技术的发展的特点：南京农业大学食品院食品微生物组微生物培养法固体培养1液体培养2连续培养3补料分批培养4混合培养5南京农业大学食品院食品微生物组（一）实验室常见的固体培养1.好氧菌培养一、固体培养(Solid-stateculture)试管斜面(test-tubeslant)培养皿平板克氏扁瓶(kolleflask)茄子瓶斜面南京农业大学食品院食品微生物组2.厌氧菌培养厌氧装置+特殊培养基六大营养素+还原剂氧化还原势指示剂，如刃天清(resazuin)南京农业大学食品院食品微生物组厌氧菌培养的装置：（1）Hungate滚管技术（2）厌氧培养皿1950年美国微生物学家R.E.Hungate设计南京农业大学食品院食品微生物组厌氧菌培养的装置：（3）厌氧罐（4）厌氧手套箱南京农业大学食品院食品微生物组（二）生产中常见的固体培养1.好氧菌的曲法培养2.厌氧菌的堆积培养法曲盘、转鼓、通风曲槽等南京农业大学食品院食品微生物组二、液体培养(Liquid-stateculture)液体培养提高溶氧速率的措施：浅层培养(Shallowliquidculture)摇床:振荡培养(Shakingflaskculture)深层培养(Submergedculture)机械搅拌提高罐压南京农业大学食品院食品微生物组（一）实验室常见的液体培养1.试管液体培养2.浅层液体培养3.摇瓶培养4.台式发酵罐南京农业大学食品院食品微生物组（二）生产中常见的液体培养1.浅盘培养2.发酵罐深层培养南京农业大学食品院食品微生物组第四节影响食品中微生物生长的因素一、食品的营养成分对微生物生长的影响食品性质具有显著分解能力的类群举例菌种蛋白质细菌霉菌变形杆菌沙门柏干酪青霉碳水化合物酵母霉菌啤酒酵母黑曲霉脂肪霉菌细菌（少数）黄曲霉荧光假单胞菌微生物对营养物质分解的选择性南京农业大学食品院食品微生物组二、温度对微生物生长的影响温度对生长速度的影响南京农业大学食品院食品微生物组根据微生物生长的适宜温度分为三大类微生物类型生长温度范围最适生长温度分布区域嗜冷微生物（Psychrophile）-10~3010~20地球两极、海洋、冷泉、冷藏食品嗜温微生物（Mesophil