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第一节测定生长繁殖的方法第二节微生物的生长规律第三节影响微生物生长的主要因素第四节微生物培养法概论第五节有害微生物的控制第六章微生物的生长及其控制MicrobialGrowthandControl第一节测定生长繁殖的方法一、测生长量二、计繁殖数1、直接法测体积法(粗放)称干重法(精确)2、间接法比浊法：分光光度法(OD)生理指标法：测含氮量1、直接法：用血球计数板在显微镜下进行计数二、计繁殖数2、间接法：用平板菌落进行的活菌计数菌数/mL=cfuX稀释度X10第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长三、微生物的连续培养方法二、微生物的典型生长曲线一、微生物的个体生长和同步生长同步生长通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态；获得同步生长的方法环境条件诱导法机械筛选法二、微生物的典型生长曲线(growthcurve)生长曲线：当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气等体积下，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如果以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标就可画出一条曲线——微生物的典型生长曲线。培养时间(h)I延滞期II指数期III稳定期IV衰亡期0生长速度总菌数活菌数IIIIIIIVlg细胞数(个/ml)二、微生物的典型生长曲线(growthcurve)Ⅰ延滞期(lagphase)⑤对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。指少量微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。①生长速率常数R等于零。②细胞形态变大或增长。③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。④合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。影响延滞期长短的因素（1）接种龄（2）接种量（3）培养基成分Ⅰ延滞期(lagphase)出现延滞期的原因？Ⅱ指数期(exponentialphase)是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。①生长速率常数R最大，代时G最短；②整个群体的生理特性较一致；④酶系活跃，代谢旺盛。③细胞各成分平衡增长，生长速率恒定；三个重要参数（1）繁殖代数(n)（2）生长速率常数(R)（3）代时(G)Ⅱ指数期(exponentialphase)G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)X2=X1·2n两边取对数：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)Ⅱ指数期(exponentialphase)x2x1t1t2影响代时长短的因素（1）菌种（2）营养成分（3）营养物浓度（4）培养温度时间8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响Ⅱ指数期(exponentialphase)Ⅲ稳定期(stationaryphase)①生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；②菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数Y表示；Y=(X-X0)/C0-C=(X-X0)/C0X：稳定期的细胞干重(g/ml培养液）X0：刚接种时的细胞干重C0：限制性营养物的最初浓度(g/ml)C：稳定时期限制性营养物的浓度③通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；①对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸)等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：②是对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；稳定期的实践意义IV衰亡期(deathphase)微生物个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态；细胞形态发生变化，出现畸形；有的发生自溶；有的合成或释放次生代谢产物；芽孢此期释放；三、微生物的连续培养方法稳定期到来的主要原因？营养物尤其是生长限制因子的耗尽；有害代谢产物的累计；理化条件的不适宜等；是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。1.恒浊器(turbidostat)2、恒化器(chemostat)是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置；主要获得不同生长速率的菌体；恒浊与恒化培养控制装置装置恒浊器恒化器控制对象菌体密度(内控制)培养基流速(外控制)培养基无限制生长因子有限制生长因子培养基流速不恒定恒定生长速率最高速率低于最高速率产物大量菌体或与菌体相平行的代谢产物不同生长速率的菌体应用范围生产为主实验室为主Turbidostat&chemostat的比较分批培养与连续培养的比较连续培养的优缺点优点高效自控产品质量稳定节约动力、人力、水和蒸汽等缺点菌种容易退化容易污染杂菌营养物的利用率低于单批培养微生物的高密度培养指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术；目前由于研究的微生物种类主要局限于E.coliandS.cerevisiae等兼性厌氧菌；第三节影响微生物生长的主要因素一、温度二、氧气三、pH值一、温度(temperature)嗜冷菌(20oC)嗜温菌(20-45oC)嗜热菌(50-60oC)嗜高温菌(80-95oC)极端高温菌(105-150oC)根据温度对微生物的影响分类ThermophileandBiotechnology来自嗜热菌的酶可在高温下稳定的催化生物化学反应；其中由Thermusaquaticus中分离出来的DNA聚合酶，Taqpolymerase，已广泛应用于PCR反应；分离自Pyrocuccusfuriosus的pfupolymerase应用于PCR反应更加稳定，而且错误率更低；二、氧气(oxygen)好氧菌(Aerobes)1.专性好氧菌(obligateaerobes)必须有氧存在2.兼性好氧菌(facultativeaerobes)有氧无氧均可，但有氧更好3.微好氧菌(microaerophilicaerobes)只在较低的氧分压下生长厌氧菌(anaerobes)4.耐氧菌(aerotolerantanaerobes)不需氧，但有氧也能生存，氧无毒害5.专性厌氧菌(obligate/strictanaerobes)氧有毒害，甚至致死微生物与氧的关系厌氧菌的氧毒害机制厌氧菌体内无SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用。去除·O2-等有害活性氧分子的机制H2O+1/2O22H2O2·O2-+2H+H2O2+O2SOD一切好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶一切好氧生物NADH2NAD过氧化物酶耐氧菌三、pH值嗜碱微生物（basophile）多数放线菌、硝化细菌、根瘤菌等耐碱微生物（basotolerantmicroorganism）若干链霉菌•嗜酸微生物（acidophile）•多数真菌•耐酸微生物(acidotolerantmicroorganism)乳酸杆菌、醋酸杆菌，许多肠杆菌等第四节微生物培养方法概论微生物培养方法生产实践实验室培养法固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养1、好氧菌的实验室培养固体培养试管斜面培养皿琼脂平板液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养（振荡培养）台式发酵罐培养2、厌氧菌的实验室培养高层琼脂柱Hungate滚管厌氧罐技术厌氧手套箱第五节有害微生物的控制一、几个基本概念1、灭菌(sterilization)采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。总菌数活菌数细胞数的对数细胞数的对数时间时间杀菌溶菌2、消毒(disinfection)消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。举例：一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法等；3、防腐(antisepsis)防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。防腐的常用措施低温缺氧干燥高渗高酸度防腐剂4、化学治疗(chemotherapy)它是利用具有高度选择毒力（selectivetoxicity，即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂；一些重要的化学治疗剂种类：各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等比较项目灭菌消毒防腐化疗处理因素强理、化因素理、化因素理、化因素化学治疗剂处理对象任何物体内外的一切微生物物体表面的病原菌物体内外的一切微生物宿主体内的病原菌作用效果彻底杀灭杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死实例加压蒸汽灭菌，辐射灭菌，杀菌剂70%酒精消毒，巴氏消毒法冷藏、干燥、糖渍、盐腌、缺氧、防腐剂抗生素、磺胺药、生物药物素灭菌、消毒、防腐和化疗的比较（一）物理方法——高温杀菌高温灭菌干热灭菌法火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法湿热灭菌(消毒)法常压下加压下巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法常规加压灭菌法连续加压灭菌法LTH法HTST法烘箱内热空气灭菌法•150~170℃1~2h彻底杀灭细菌；•适用于金属和玻璃器皿的灭菌；火焰灼烧法•仅适用于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。干热灭菌法1、热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；2、热蒸汽比热空气穿透力更强；3、蒸汽存在潜热，当气体转变成液体时可放出大量热量；4、可迅速提高灭菌物体的温度。相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌好；湿热灭菌法比较项目干热90℃90℃相对湿度20%80%白喉棒杆菌24h2h2min痢疾杆菌3h2h2min伤寒杆菌3h2h2min葡萄球菌8h3h2min干热与湿热空气对不同细胞的致死时间巴氏消毒法一种低温湿热消毒法。低温维持法(Lowtemperatureholdingmethod,LTH)63℃30min高温瞬时法(Hightemperatureshorttime,HTST)72℃15s巴氏消毒法间歇灭菌法(fractionalsterilization)80~100℃15~60min杀灭所有微生物的营养体；37℃或室温保温过夜，诱发芽孢萌发为营养体；重复上述步骤三次，在较低的灭菌温度下彻底灭菌；适用于不耐热培养基的灭菌。高压蒸汽灭菌法121℃；15-20min；1kg/cm2是被广泛使用的方法；高压蒸汽灭菌锅构造1、压力表2、安全阀3、放气阀4、软管5、紧固螺栓6、灭菌桶7、筛架8、水手提式高压蒸汽灭菌锅1、加水至止水线；2、灭菌物品包裹好；3、开启放气阀；4、加热排气；5、达到预定表压，开始计时；6、关闭热源，当压力降至0.05MPa时，缓慢开启放气阀。高压蒸汽灭菌锅使用方法4、过滤1、低温冷藏法冷冻法2、辐射：紫外线、电离辐射和强可见光等3、干燥和渗透压（高渗）其他物理控制方法过滤除菌（二）化学方法杀菌1.表面消毒剂(surfacedisinfactant)是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。类型名称及使用浓度作用机制应用范围醇类70-75%乙醇使膜损伤、蛋白质变性皮肤、器械醛类0.5-10%甲醛破坏蛋白质氢键或氨基物品消毒，接种箱、接种室的熏蒸酚类3-5%石炭酸蛋白质变性，损伤细胞膜地面、家具、器皿表面活性剂类0.05-0.1%新洁而灭蛋白质变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、手术器械染料2-4%龙胆紫与蛋白质羧基结合皮肤、伤口氧化剂类0.1%高锰酸钾氧化蛋白质的活性基团皮肤、尿道3%双氧水污染物件表面重金属类