发酵工程第二章发酵工业菌种

本章内容一、常用发酵工业菌种二、发酵工业菌种的分离筛选三、发酵工业菌种鉴定四、发酵工业菌种改良四、发酵工业菌种保藏第一节常用发酵工业菌种工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵工艺和后提取工艺三个因素，其中拥有良好生产菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品的产量、质量及其成本。例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有40U·1，得到黄色晶体，青霉素纯度很低，价比黄金；而现在采用新型菌种可以达到60000U·1以上，得到晶体为纯白色，青霉素纯度高达95%以上，成本不到0.1元。青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种在其中起了关键作用。菌种选育有何意义？微生物菌种是决定发酵产品的工业化价值以及发酵过程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。优良菌种都是通过菌种选育获得的。菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种。菌种选育的意义：提供产量提高产品质量改善加工工艺和开发新产品。在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种的遗传学性质2.1工业发酵菌种概述110010微生物物种已发现物种被利用物种工业发酵微生物可培养微生物未培养微生物少数大多数缺乏敏感检测技术培养基中营养过剩微生物间相互作用认识不足无法原位培养细菌放线菌酵母菌霉菌细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌主要用于生产酶制剂、有机酸、氨基酸、肌苷酸等。醋酸杆菌生产醋酸、山梨醇、5-酮葡糖酸和酒石酸等；乳酸菌广泛应用于乳酸的生产以及乳制品工业；产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等可生产氨基酸、核苷酸等；梭状芽孢杆菌可生产丁二醇、丙酮、丁醇、乙醇、丙酮丁醇、核黄素以及一些有机酸；枯草芽孢杆菌可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、多肽类抗生素、氨基酸、维生素以及丁二醇等；假单胞菌能生产维生素B12、色素、丙氨酸、葡糖酸以及一些抗生素和甾体等；黄单胞菌可生产维生素B12；运动单胞菌可生产乙醇；大肠杆菌可生产天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸以及谷氨酸脱羧酶、天冬酰酶等。细菌还用作基因工程载体的宿主细胞，用于构建基因工程菌来生产外源物质，如：利用大肠杆菌生产核酸和蛋白质疫苗。放线菌链霉菌属小单孢菌属诺卡菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌主要用于生产多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属主要用于生产食用、药用和饲料用蛋白等。酵母细胞本身含有丰富的蛋白质、维生素以及各种酶类，工业上常通过培养酵母制造单细胞蛋白，以供食用或作饲料蛋白，或用来制取核糖核酸、核苷酸、核黄素、细胞色素c、辅酶A、凝血质、转化酶和乳糖酶等。在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产品。霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉主要用于生产酶制剂、有机酸、抗生素及甾体激素等。霉菌除了应用于传统的酿酒、制浆和其他发酵食品生产外，还可用于生产乙醇、有机酸、抗生素、酶制剂、维生素、植物生长素以及甾体转化等。黑曲霉用于生产酸性蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸、草酸以及抗坏血酸等；红曲霉能发酵生产红曲红色素、红曲黄色素、柠檬酸、琥珀酸、麦角固醇、洛伐他丁、淀粉酶、蛋白酶和酯化酶等；产黄青霉用于生产青霉素、葡糖酸、抗坏血酸以及多种酶；根霉能产生反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸、芳香脂和甾族化合物等；毛霉能产生果胶酶、凝乳酶、甾族化合物以及应用于传统的制酱工业等。未培养微生物定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％，主要在各种极端环境中。研究方法1、模拟自然培养法：原位培养、培养条件优化、单细胞操作。2、宏基因组分析法：测序分析未培养微生物的基因组，结合蛋白质组学，了解其代谢途径、基因表达调控机制等。第二节发酵工业菌种的分离筛选菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。菌株的分离和筛选是获得目的菌株的两个重要环节。分离：筛选：注意采用方法的选择性和灵敏度菌种选择的要求能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。从自然界筛选菌种制定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。预处理：提高菌种分离的效率富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。菌种的筛选：通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能力较高的菌株。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。菌种保藏新种分离与筛选的步骤1.样品采样（1）采样原则广泛性充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）如根据微生物的营养类型：纤维素酶产生菌——森林土壤蛋白酶和脂肪酶产生菌——肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥利用碳氢化合物为碳源的菌株——油田附近极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：高温酶产生菌——南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆耐压菌——油井或海洋深处（有机质丰富、通气保水性能好）(2)采样对象土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：有机质含量和通风状况耕地、菜园山坡上的森林沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地取样的土层深度：5-25——细菌、放线菌（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌——微生物少1.采样③土壤的酸碱度④偏碱——细菌、放线菌⑤偏酸——霉菌、酵母菌⑥土壤的植被状况⑦葡萄成熟时——根部酵母菌增多⑧地理条件⑨南方土壤比北方土壤微生物含量多⑩季节条件11秋季菜土样最理想2.样品的预处理（1）物理方法热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高从而增加目的菌的比例。膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。离心法：同上。（2）化学法通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。如：用添加3稳定培养基的来分离嗜碱性的放线菌。（3）诱饵法将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。3.富集培养富集培养利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的优势种。3.富集培养富集培养的策略（1）控制培养基的营养成分用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。3.富集培养富集培养的策略（2）控制培养条件溶氧浓度——好氧/厌氧高温——嗜热微生物/非嗜热微生物——嗜酸性/嗜碱性4.菌种分离平板划线分离法稀释分离法毛细管分离法小滴分离法•划线分离法——平板划线法稀释分离法•稀释倒•平板法•平板•涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；①初筛初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。初筛可分为两种情况进行：a.平板筛选对于在分离纯化阶段没有进行平板定性法挑选出来的菌株，可以先进行平板定性筛选。在初筛时，使用平板快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平板上肉眼可见的显色或生化反应，可以减少筛选的工作量，大幅度地提高筛选效率。微生物选择性分离的原理和方法在菌种的分离筛选过程中，为了提高筛选的效率，通常要根据菌种的特性，设计具有选择性的分离筛选方案，通过控制营养和培养条件以有利于待分离菌株的生长和抑制非目的微生物的生长，或通过添加显色剂、指示剂以方便待分离菌株的挑选。在常见选择性分离方法中，除了控制培养基营养成分和控制培养条件外，还有根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计选择培养基，通过观察微生物在选择培养基上生长状况或生化反应进行分离的方法。这种利用平板的生化反应进行分离的方法有以下几种：①变色圈法;②透明圈法;③生长圈法;④抑菌圈法.①变色圈法在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分解底物或代谢产物引起平板上出现变色圈，使所需微生物能够被快速鉴别出来。例如，用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板筛选果胶酶产生菌，菌落长成后加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈；用加入溴百里酚蓝的平板培养基分离谷氨酸产生菌时，若平板上出现产酸菌，其菌落周围就变成黄色，可从黄色圈中挑取菌落。②透明圈法在平板培养基中加入溶解性差的底物，使培养基浑浊，能够分解底物的微生物就会在菌落周围产生透明圈，根据透明圈的大小可以初步判断菌株利用底物的能力。例如，以淀粉为唯一碳源的平板培养基分离淀粉酶产生菌时，形成菌落后用碘液浸涂，产淀粉酶菌株周围会出现透明的水解圈，据此可挑取所需菌落。③生长圈法生长圈法所用的工具菌是一些营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上，进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养物，在该菌株的菌落周围就会形成一个浑浊的生长圈。例如，用嘌呤缺陷型大肠杆菌作为工具菌，与不含嘌呤的培养基混合倒平板，在平板培养基上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。b.摇瓶发酵筛选平板法是固体培养，与液体培养的条件差距较大，而摇瓶振荡培养法更接近发酵罐的培养条件，摇瓶发酵筛选得到的菌株易于推广，因此，经过平板定性筛选的菌株须进行摇瓶培养筛选。一般一个菌株接一个瓶，在一定转速的摇瓶机上以及适宜的温度下进行振荡培养，得到的发酵液进行目的产物检测或进行菌种活性测定，通过比较可以初步筛选出少量生产能力较高的菌株。④抑菌圈法抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏感菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板培养基上进行培养，若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，就会在被检菌的菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。例如，等提出一套利用抑菌圈筛选青霉素酰化酶产生菌的方法。工具菌是一种对6-氨基青霉烷酸敏感而对苄青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，这种菌只有当苄青霉素尚未被别种微生物的青霉素酰化酶转化为6-氨基青霉烷酸时才能生长。将工具菌与苄青霉素混合于平板培养基中，然后将待检菌涂布于平板上，进行培养，周围出现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。②复筛对初筛出来的菌株进行复筛时，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复3~5个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株，一般需经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产，因此，复筛出来的菌株通常作为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。复筛过程中，要结合各种培养条件进行筛选，在不同培养条件下进行试验，以便初步掌握野生型菌株适合的培养条件，为育种提供依据。细菌分离：以乳酸菌为例取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h培养基中长