降血糖药物筛选方法.

降血糖药物筛选方法2010年11月5日导论动物水平筛选细胞水平筛选酶和受体水平筛选总结和思考糖尿病（DM,DiabetesMellitus）糖尿病为一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。指标：餐后2h血糖高于11.1mmol/L空腹血糖高于7.0mmol/L发病率全球糖尿病患者人数已超过1.77亿，预计到2025年将达到3.7亿，成为继心血管和肿瘤之后第三位“健康杀手”（WHO）。中国糖尿病发病率达5%，全国糖尿病患者人数已在3000万以上，糖尿病患者的人数仅次于印度居世界第二位。世界糖尿病日纪念胰岛素的发现者班廷的诞辰，世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟（IDF）将班廷医生的生日11月14日定为世界糖尿病日（WDD）。班廷，Banting，加拿大生理学家（1891-1941）控制糖尿病，刻不容缓！（Let'stakecontrolofdiabetes.Now！）糖尿病的事实全球每30秒就有一人因糖尿病而截肢。每年死于糖尿病的人远远高于死于艾滋病的人。2005年，全球约290万人死于糖尿病。每年患糖尿病的人数增加700万，而且多数集中在亚洲。每10秒中，就有人死于糖尿病相关性疾病；同时，就有2例新病例被诊断．在发达国家，糖尿病是成年人失明和视力障碍的主要原因。2型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。肥胖是2型糖尿病的主要危险因素。并发症糖尿病可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变、肢体坏疽以致截肢、昏迷等多种并发症。治疗药物磺脲类：格列本脲（优降糖）格列齐特（达美康）格列吡嗪（美吡达）格列喹酮（糖适平格列美脲（亚莫利）双胍类：苯乙双胍（降糖灵）二甲双胍（美迪康）α糖苷酶抑制剂：阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣）胰岛素增敏剂：罗格列酮（文迪雅）胰岛素：诺和灵、优泌林二、动物水平筛选2.1I型糖尿病动物模型造模方法：采用化学试剂破坏胰岛细胞造模或因为遗传因素，胰岛细胞受到自身免疫性破坏而产生的。1）化学试剂诱导的高血糖动物模型链脲霉素（四氧嘧啶）诱导的高血糖动物模型链脲霉素诱导的高血压动物模型原理：含亚硝基的化合物特异性破坏胰岛β细胞诱导NO大量合成激活自身免疫过程STZ量决定细胞损伤程度：凋亡（低剂量）高剂量（坏死）链脲霉素结构方法：一次性大剂量静脉或腹腔注射STZ大鼠（60-80mg/kg）小鼠（100-200mg/kg）注意：STZ水溶液不稳定，生物半衰期5min，造模时新鲜配置、快速注射。结果：注射72小时后，血糖稳定升高，动物出现三多症状（多食、多饮、多尿）。优缺点：造模快速、模型稳定、组织毒性小；但价格昂贵2）自发性糖尿病大鼠（BB大鼠）渥太华Biobreeding实验室培育出来的自发遗传I型糖尿病大鼠。发病机制：自身免疫性破坏胰腺β细胞引发胰腺炎发病特征：于出生后60日发病，体重减轻，糖尿，低胰岛素，胰腺炎、胰岛细胞减少，须胰岛素治疗才能生存。2.2II型糖尿病动物模型II型糖尿病动物模型的病理生理改变胰岛素抵抗增加基础肝糖输出率增加，空腹高血糖胰岛细胞功能减退胰岛素抵抗的出现，为维持血糖稳定，胰岛细胞分泌胰岛素代偿性增加，最终导致细胞分泌功能障碍，发展为糖尿病。1）高糖高脂饮食诱发II型糖尿病动物模型方法：采用占热量61%高脂饮食（饱和脂肪酸的动物脂肪，蛋白质19%，碳水化合物20%，脂肪61%），饲养3-6周。指标：血糖升高，胰岛素水平升高，出现明显的胰岛素抵抗。优缺点：模拟人类高糖高脂膳食诱发糖尿病模型；但造模时间较长，成本高，不稳定。2）自发性糖尿病大鼠（PO大鼠）PO大鼠又称嗜沙肥鼠发病特征：出生两周后，90%PO大鼠出现明显的胰岛素抵抗症状。发病阶段：起始阶段，血清及胰岛素水平正常胰岛素水平升高，血糖正常高胰岛素水平，高血糖水平胰岛细胞受损，导致低胰岛素和高血糖3）肥胖高血糖小鼠（ob/ob小鼠）发病特征：体型极胖，早期有高血糖和糖尿，血清胰岛素水平高，有明显的胰岛素抗性。胰岛肥大增生，胰岛素含量增加。用途：胰岛素增敏剂的研究4）糖尿病小鼠（db/db小鼠）发病特征：体型极胖，脂肪沉淀，早期有高血糖和糖尿，高胰岛素血症，晚期可见胰岛细胞坏死。2.3降糖药物体内药效评价方法利用糖尿病动物模型评价药效，主要以空腹血糖、糖耐量及胰岛素敏感性为指标。a）空腹血糖测定取材：动物禁食过夜，次日眼眶采血，测定血糖浓度。方法：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法以及血糖仪。葡萄糖氧化酶法（国内推荐方法）葡萄糖+O2葡萄糖氧化酶葡萄糖酸+H2O2H2O2+4-氨基安替吡啉+酚过氧化物酶醌亚胺+H2O醌亚胺在480-550nm有最大吸收峰，醌亚胺与葡萄糖的量成正比，比色法测定醌亚胺的量，即可得到葡萄糖浓度。原理：方法：葡萄糖氧化酶过氧化物酶磷酸缓冲液酚4-氨基安替吡啉孵育15min505nm测定吸光度OD结果：局限：还原性物质如尿酸、维C、胆红素等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，使测定结果偏低举例：葡萄糖浓度=A样品-A空白A标准-A空白X标准浓度（mM）样品OD葡萄糖浓度（mM）空白0.050标准品0.955.0样品A0.5?样品B0.35?血糖仪方法：手指采集1ul血样，将试纸顶端轻靠血样，试纸就可以自动吸收血样，插入血糖仪，只需5秒快速显示测试结果特点：方便、快速、简单，主要用于糖尿病患者日常监控血糖，但准确度稍差。b）糖耐量试验口服糖耐量试验：糖尿病诊断主要指标，也是降糖药物药效评价的主要指标。原理：口服葡萄糖后，血糖迅速上升，刺激胰岛素分泌，肝糖元合成增加，血糖持续下降。正常人服用葡萄糖30-60min，血糖达到最高峰，之后迅速下降，在2h左右，血糖降至正常。糖尿病时，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超过正常，且2h不能下降到正常。方法：实验前动物过夜禁食，灌胃给葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），或淀粉（3-5g/kg）。测定给糖后0h，0.5h，1h，2h血浆血糖浓度，并绘制血糖变化曲线。结果：葡萄糖耐量试验050100150200250300050100150200口服葡萄糖后时间（min）葡萄糖浓度（mg/dl）sample1sample2sample3哪一个样本是糖尿病鼠？哪个是降糖药治疗后样本？c)胰岛素释放试验目的：检查胰岛功能和胰岛素分泌水平原理：I型糖尿病，空腹胰岛素水平很低；II型糖尿病，空腹胰岛素水平正常或偏高，葡萄糖刺激后，胰岛素分泌增加；部分药物可促进胰岛素分泌，提高胰岛素水平方法：灌胃给葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），或淀粉（3-5g/kg）.测定给糖后0h，0.5h，1h，2h血浆胰岛素浓度，并绘制胰岛素变化曲线。胰岛素测定方法（ELISA）：原理：预先包被胰岛素抗体在ELISA板上，加入样品后，样品中的胰岛素与包被抗体结合，再加入生物素标记的抗胰岛素单克隆抗体，结合已俘获胰岛素的另一端，最后加入过氧化酶标记的抗生物素，生物素与抗生物素结合。通过过氧化物酶底物显色来定量测定样品中的胰岛素。方法：胰岛素测定试剂盒（wako）组成：抗胰岛素包被板；胰岛素标准溶液；生物素标记的抗胰岛素抗体；HRP标记的链酶亲和素；显色底物；终止液；洗涤液试验操作：参见试剂盒说明结果：胰岛素标准曲线样品OD胰岛素水平10.85ng/ml20.10.3ng/ml31.58.5ng/ml胰岛素释放试验010203040506070020406080100120140口服葡萄糖后时间（min）胰岛素浓度（ng/ml）sample1sample3sample2胰岛素释放试验05101520253035020406080100120140口服葡萄糖后时间（min）胰岛素浓度（ng/ml）sample1sample4图１哪个样品为正常，I型或II型病人？图２哪个为治疗前或治疗后？图３哪个为治疗前或治疗后？图１图２胰岛素释放试验010203040506070020406080100120140口服葡萄糖后时间（min）胰岛素浓度（ng/ml）sample2sample5图３d)葡糖钳技术(glucoseclamptechnique)葡糖钳技术是美国耶鲁大学医学院于1979年创立的一种临床测定胰岛素分泌或胰岛素敏感性的定量技术。正糖钳：对胰岛素的敏感性的定量分析，是国际上公认的评估胰岛素敏感性和β细胞功能的“金标准”。正糖钳技术原理：静脉注射胰岛素使其维持高水平；同时静脉注射葡萄糖使血糖维持在基础血糖水平上。高胰岛素水平代谢葡萄糖，为维持血糖需不断注射葡萄糖，当葡萄糖注射速率平衡时，此时的速率相当于体内代谢葡萄糖的速率。1983发展大鼠正糖钳试验。Dr.JimLiebau方法：大鼠麻醉颈静脉插管接三通管，两个进口端一侧输入10%葡萄糖，一侧输入胰岛素，出口端接静脉插管手术完毕，输入4mU/kg/min胰岛素，同时输入10%葡萄糖每隔10min测定血糖血糖输入速率至稳态后，记录连续60min葡萄糖输注速率稳态下6次葡萄糖输注速率平均值为GIR，6次血糖平均值为BG结果：稳态葡萄糖注射速率GIR值11.56mg/kg/min血糖平均值BG值4.13mM哪个样品胰岛素敏感度高？哪个样品是来自药物治疗后大鼠？02468101214161820GIR（mg/kg/min）sample1sample2胰岛素-正糖钳试验三、细胞水平降糖药物筛选脂肪细胞（肝细胞）-葡萄糖消耗葡萄糖转运试验1.3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗实验脂肪细胞11mM葡萄糖含药培养液培养24或48h检测培养液中葡萄糖消耗量葡萄糖氧化酶法计算葡萄糖消耗量阳性药物可选择二甲双胍糖消耗量(mM)=11mM-培养基葡萄糖浓度(mM)2.3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运实验脂肪细胞加药培养24h0.5uCi/ml2-deoxy-[H]-D-glucose3孵育10min加NaOH裂解细胞细胞裂解液KRP缓冲液清洗3次[H]含量同位素测定仪KRP缓冲液组成：131.2mMNaCl，4.7mMKCl，2.47mMCaCl2，1.24mMMgSO4,2.48mMNaH2PO4,10mMHEPES3b-细胞损伤模型H2O2链脲霉素四氧嘧啶b-细胞胰岛素分泌模型b-细胞ATP敏感钾通道阻断剂四、分子水平降糖药物筛选4.1a-糖苷酶抑制剂筛选原理：饮食中淀粉和蔗糖(双糖)不能直接被肠壁细胞吸收，需要在小肠绒毛上的多种α-葡糖苷酶的作用下生成单糖(葡萄糖及果糖)后才能被吸收。α-糖苷酶上具有与寡糖及双糖相结合的位点，药物与这个位点结合，能可逆性地抑制小肠绒毛上的多种α-葡糖苷酶的活性。α-糖苷酶有多种，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麦芽糖酶；糊精酶。阿卡波糖阿卡波糖与α-蔗糖酶结合位点方法：p-NPG(底物)磷酸缓冲液0.2U/mla-糖苷酶一定浓度药物保温30minNa2CO3终止反应405nm测定释放p-NP量p-NPG为对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（无色）p-NP为对硝基苯酚（黄色）4.2蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)抑制剂筛选原理：蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)是胰岛素信号转导通路的负调节因子，与II型糖尿病密切相关。PTP-1B过度表达将会使胰岛素受体去磷酸化，无法与胰岛素结合，引起胰岛素抵抗。方法：结果：p-NPP液PTP-1B酶液一定浓度药物37度孵育0min405nm处测定吸光度OD值PTP-1B活性=（给药组OD10min-给药组OD0min)（对照组OD10min-对照组OD0min)x100%37度孵育10minp-NPP为对硝基苯磷酸酯(无色)；p-NP为对硝基苯酚(黄色)总结一、动物水平筛选模型：I型（链霉素诱导高血糖动物模型）II型（高脂饮食、PO大鼠）药效评价：血糖测定（葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、血糖仪）糖耐量试验；胰岛素释放试验；胰岛素敏感性试验(葡糖钳技术)二、细胞水