生物化学核酸化学

核酸与蛋白质是最重要的生物大分子。核酸有两类：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。第一节核酸概述一、核酸的研究发现史1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种富含磷的酸性物质，即现在被称为脱氧核糖核蛋白的物质。1889年，Altman等从酵母和动物的细胞核中制备了不含蛋白质的核酸，首次使用“核酸”一词命名。1944年，Avery的肺炎双球菌转化实验：orand可分离揭示了核酸的生物学功能；98％细胞核内（染色体中）真核细胞线粒体核外叶绿体DNA拟核原核细胞核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒二、核酸的种类和分布核酸按其所含糖的不同分为两大类：脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中；转移RNA（transferRNA,tRNA）占细胞总RNA的10～15％;核糖体RNA（ribosomeRNA,rRNA）占细胞总RNA的80％;信使RNA（messengerRNA,mRNA）占细胞总RNA的5％;其它具特殊功能的RNA;RNA病毒;植物病毒基因组大多是RNA三、核酸的生物学功能DNA是主要的遗传物质，是遗传信息的载体、负责遗传信息的储存与发布，并通过复制将遗传信息传给子代。RNA功能的多样性：1、参与蛋白质的生物合成2、RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达与细胞功能的调节4、生物催化作用5、遗传信息的加工与进化第二节核酸的结构元素组成：CHONP核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)戊糖(pentose)碱基(base)核酸由核苷酸组成，核苷酸又由碱基、戊糖与磷酸组成；组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。一、戊糖OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖RiboseDeoxyribose二、碱基1.嘌呤碱123456978NNNHNNH2腺嘌呤AdenineANHNNHNONH2鸟嘌呤guanineG嘌呤两类核酸中的嘌呤碱基完全相同；2.嘧啶碱123456尿嘧啶uracilNHNHOOUNNHNH2O胞嘧啶cytosineCNHNHOO胸腺嘧啶thymineT嘧啶胞嘧啶为两类核酸所共有，胸腺嘧啶只存在于DNA中，尿嘧啶只存在于RNA中；核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖+碱基糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键，核酸分子中为β－糖苷键。1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)为与碱基分子中的原子标号相区别，糖的碳原子编号加上’。胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2假尿嘧啶核苷（ψ）二氢尿嘧啶核苷等；5OHAdenosineGuanosineCytidineUridine常见核苷：稀有核苷：四、核苷酸（nucleotide）核苷酸：核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化核苷+磷酸戊糖+碱基+磷酸HHHHHHHHHOHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖五、核苷酸衍生物1.继续磷酸化O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)AMPADPATP2.环化磷酸化3‘，5’-环腺苷酸（cAMP）3‘，5’-环鸟苷酸（cGMP）3.肌苷酸及鸟苷酸(强力味精)4.辅酶NAD、NADP、FMNIMPGMP六、多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3’-OH与另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。5’5’3’3’5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH第三节DNA的结构一、DNA的一级结构脱氧核苷酸的排列顺序；可用碱基排列顺序表示连接键：磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架碱基形成侧链多核苷酸链的方向性；DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。二、DNA的二级结构DNA的双螺旋模型1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基础上，提出了著名的DNA双螺旋结构模型。DNA双螺旋结构模型要点2.0nm小沟大沟1、由两条方向相反的DNA单链沿同一中心轴，平行盘绕形成的右手螺旋，螺旋表面有大沟和小沟之分；；2、碱基位于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧；糖环平面与中轴平行。3、螺旋直径为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34nm；每10个核苷酸形成一个螺旋，螺矩为3.4nm。4、严格遵守碱基互补原则：A-T，之间形成两个氢键；G-C，之间形成三个氢键；A＝T，G＝C，且A+G=C+T;DNA双螺旋构象的多态性除B型结构外，还有：A型结构碱基平面倾斜20º，螺旋变粗变短，螺距2～3nm。Z型结构左手螺旋，只有小沟稳定双螺旋结构的力①碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）。②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，减少双链间的静电斥力④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。二、DNA的三级结构细胞中，由于DNA与其他分子的相互作用，使双螺旋进一步扭曲和折叠形成的构象超螺旋是DNA三级结构的主要形式，有正超螺旋和负超螺旋之分；天然环状DNA一般都以负超螺旋构象存在；负超螺旋正超螺旋第四节RNA的结构与功能一、结构特点1.碱基组成A、G、C、U（A＝U/G≡C）稀有碱基较多，稳定性较差，易水解2.多为单链结构，可发生分子自身回旋，互补碱基区形成局部螺旋结构，不能配对碱基区形成突环；3.分子较小(相对于DNA而言)4.分类mRNAtRNArRNA其他具特殊功能的RNA少数RNA病毒二、tRNA•三叶草形二级结构模型；•碱基配对构成双螺旋区叫臂，不配对部分叫环，tRNA一般具四臂四环结构；氨基酸臂二氢尿嘧啶环反密码环额外环TψC环（假尿嘧啶环）•碱基组成中含有较多的稀有核苷酸；倒L形的三级结构tRNA的三级结构tRNA的功能：●转运氨基酸●识别密码子●参与翻译起始●参与DNA的反转录●参与基因表达调控三、rRNA占RNA总量的80％，是构成核糖体的骨架；原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA30s70s50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28srRNA的功能：●组成核糖体●催化肽键合成●参与tRNA与mRNA的结合大肠杆菌5SrRNA的结构四、mRNA是蛋白质合成的模板，占细胞总RNA的3％～5％；真核细胞mRNA的结构有明显特征，3‘-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5’-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。甲基鸟苷5’，5’-三磷酸尾结构：●转录后由poly(A)聚合酶催化加尾●PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。●polyA与mRNA半寿期有关，PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。●由甲基化酶催化形成；●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA；●可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成；帽结构：第五节核酸的性质一、一般的理化性质两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），DNA的pI为4～4.5，RNA的pI为2～2.5。提纯的DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，微溶于水，不溶于有机溶剂；能被乙醇或异丙醇沉淀。DNA分子由于直径小而长度大，溶液粘度高；RNA分子粘度较小；核酸变性后粘度降低。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解；核酸分子在缓冲液中带有电荷，可利用电泳进行分离；二、核酸的紫外吸收特性嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，核酸（包括碱基、核苷、核苷酸）具有独特的紫外线吸收（240－290nm强吸收）光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰以A260/A280进行定性、定量DNA的减色效应DNA和RNA溶液中加入溴乙锭（EB），在紫外光下发出红橙色荧光；三、核酸的变性、复性与分子杂交1.变性稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度加热DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。通常将紫外吸收达最大量（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称熔点或熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.热变性和Tm3.核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度4.分子杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern印迹法（Southernbolting）Northern印迹法（Northernbolting）Western印迹法（Westernbolting）本章小结核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示）、二级结构（Watson－Crick双螺旋模型、Z－DNA）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交复习题1、DNA分子具有哪些结构特征？2、稳定DNA双螺旋结构的因素有哪些？3、核酸具有哪些性质？