激发光谱与发射光谱原理及应用-学生讲义

1激发光谱与发射光谱原理及应用（一）实验目的与要求目的：1、了解激发光谱与发射光谱在物质定性及定量分析中的原理和方法2、学习荧光光度计的使用方法要求：1、掌握激发光谱与发射光谱测定的原理；2、理解激发光谱与发射光谱在物质定性及定量分析中的基本应用；3、了解荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；4、学习利用Origin软件处理实验数据。（二）实验原理利用某些物质受光照射时所发生的荧光的特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法，称为荧光光谱分析。当物质吸收了特征频率的光子，就由原来的基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约10-9秒之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即是荧光。产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射于检测器上,调节发射单色器至各种不同波长处,由检测器测出相应的荧光强度，然后以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。荧光发射光谱反映物质下能级的信息。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激发光谱，又称激发光谱。荧光激发光谱反映物质上能级的信息。紫外－可见光区荧光的产生，是由第一电子激发态的最低振动能级跃迁至电子基态的各个不同振动能级所致，而与荧光物质分子被激发至哪一个能级无关。因此，荧光光谱的形状与激发光的波长无关。溶液的荧光强度与该溶液的吸光强度及荧光物质的荧光效率有关。荧光的相对强弱，与很多因素有关，可用下式表示：2)1(0bceIkF(1)式中F表示荧光强度；K是仪器常数；φ为荧光量子产率；I0是激发光强度；ε是样品的克分子消光系数；b为样品池的光径长度；c为样品浓度。当浓度很稀时(1)式可近似为下式：bcIkF0(2)从此式可知，在低浓度条件下，样品浓度和荧光强度呈线性关系。溶液的荧光强度还受到溶剂、溶液温度和pH值的影响。溶液的荧光强度还会因荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而降低，这种现象称为荧光猝灭。进行荧光分析的仪器称为荧光光度计。它由以下五部分组成。光源荧光光度计多采用氙灯作为光源，因它具有从短波紫外线到近红外线的基本上连续的光谱，以及性能稳定、寿命长等优点。近年来激光荧光分析应用日广，它采用激光器作为光源，有氮激光器、氩离子激光器、可调谐染料激光器和半导体激光器等。染料激光器有连续波和脉冲两大类。单色器是从复合光色散出窄波带宽度光束的装置，由狭缝、镜子和色散元件组成。色散元件包括棱镜和光栅。荧光光度计有两个单色器：激发单色器和发射单色器。试样容器也称样品池，通常用石英或合成石英制成，玻璃容器因会吸收波长323nm以下的射线,不适用于323nm以下的荧光分析。对于溶液试样的荧光分析，光源、试样容器和探测器通常排成直角形，对于不透明的固体试样，则排成锐角形。检测器通常采用光电倍增管作为检测器，灵敏度较高。显示装置有表头显示、数字显示和记录器等。近年来荧光光度计大多配有微处理机，其信号经处理后在荧光屏上显示，并输给记录器记录。荧光光度计可分为单光束与双光束两种。在单光束荧光光度计中，光源发出的光经激发单色器单色化的光只有一束，照射在样品池上，样品发出的荧光经过3发射单色器色散后照射在光电倍增管上（图2），然后用光度表进行测量。双光束荧光光度计经过激发单色器色散的单色光由旋转镜分为两束，在不同瞬间分别将光会聚于样品池和参比池上。样品溶液和参比溶液发出的荧光进入发射单色器,然后照射在检测器上（图3）。本实验采用F4600荧光光度计测量ZBLAN：Er3+的荧光发射光谱和激发光谱。（三）仪器与样品仪器：F4600荧光光度计样品：ZBLAN：Er3+1%inmol（四）实验步骤与内容1、实验仪器的准备：用通讯电缆把荧光光度计和计算机连接起来，然后打开光度计和计算机的电源；荧光光度计的两个绿灯（Run,Xelamp）亮；启动Windows操作系统，启动FLsolutions程序；光度计开始初始化，并进行自检；当荧光光度计自检结束，处ready状态时，则可以开始测量；2、将待测样品放置于样品架上，注意放置样品的位置，使激发光能落在样品上并且样品发出的光能进入探测器；3、点击method进行参数设定，参数设定完成，机器处于ready状态后，点击measure进行测量；4、先将发射波长确定为550nm，测量样品的激发光谱；5、根据测得的激发光谱，选定一个激发波长测量样品的发射光谱；46、根据测得的发射光谱，选择各主要发射峰，分别测量其激发光谱，比较并对结果进行分析；7、选择不同的激发波长，分别测量其发射光谱，比较并对结果进行分析；8、将实验数据转化为txt文件，存储，然后利用origin软件画出光谱图，实验数据处理时用人工的方式去掉光谱中的二次线；9、测量结束后，终止FLsolutions程序；关光度计电源；关计算机；（五）思考题1、光谱中的二次线是如何产生的？