细菌性食源性疾病及其病原学检验规程

上海市疾病预防控制中心陈悦细菌性食源性疾病及其病原学检验规程细菌性食源性疾病•由细菌通过摄食而进入人体的，使人体患感染性或中毒性的一类疾病。属食源性疾病范畴，主要包括细菌性肠道传染病和细菌性食物中毒细菌性肠道传染病•属我国法定传染病，主要包括霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒及新近参照传染病管理的由肠出血性大肠埃希菌O157引起的出血性肠炎细菌性食物中毒•人体摄入了被细菌或其毒素污染的食品后所出现的非传染性急性、亚急性疾病细菌性食源性疾病处置程序•细菌性食物中毒应急处理程序（附图1）•首接单位可能是区县疾控中心或区县卫监所•卫生监督所负责调查处理，疾控检验机构配合检验•细菌性肠道传染病应急处置程序（附图1）•联合应急处理小组中疾控中心负责流调和病人采样，卫生监督所负责卫生调查和食品环节采样现场调查•根据患者的临床症状，核实诊断，初步判断是否属食物中毒或食源性疾病•现场流行病学个案调查•卫生学调查•确定常见细菌性食源性疾病和食物中毒的样品采集种类与范围和相关检验项目细菌性食源性疾病的主要临床特征（附表1）•细菌性食源性疾病有关症状与病原学检验项目、检验样品关系•（附表2）样品采集流程•样品采集与送检流程•无菌采样方法采集•及时做好样品标记，完整填写采样送检申请单（见附表4）•详细填明检样名称、来源、送检时间、中毒情况、患者主要临床症状、检验项目等样品采集数量•学校等集体单位至少采集新发病人或具有典型的临床症状、未经过抗生素治疗的样品（粪便或肛拭）10份•可疑食品应采集5份（留样食品、原配料、半成品）•食品容器、用具和加工设备等环节采样5－10份•食堂或盒饭公司从事食品从业人员进行肛拭采样样品采集注意事项•采样用的试管、瓶子、盛器、剪刀、镊子、棉拭等均应无菌•采样用的生理盐水、卡里运送培养基及有关试剂等都应该满足新鲜、无菌的要求，同时应符合采样所需要的试剂量，卡里运送培养基为5ml/管为宜•肛拭、食品和环节等采样，其采样量须满足必须开展的检验项目的要求，如肛拭采样至少要用2根棉拭，食品采样应尽量多于25g（ml）以上•采样的同时，应及时做好样品标记，完整填写采样单。立即将检样送检验室，并有交接手续各类样品采集方法（1）•可疑食物、水样：将残余食物或水样用灭菌镊子或匙采取后置于灭菌容器中。体积较大的鱼、肉应在表面消毒后取内部检样。罐头样品可直接送检•环节样品：炊事用具如锅、碗、刀、抹布、操作人员的手等用棉拭涂擦采样，菜墩用刀刮取表面后将刮取物放入灭菌容器中各类样品采集方法（2）•粪便、肛拭：粪便标本应尽量在病程早期和治疗前采集，同时应采集新鲜粪便，选取有脓血、粘液部分3-5克、水样便取含絮状物的2-5ml，盛于无菌容器中及时送检。若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4-5cm深处（小儿2-3cm），轻轻转动一圈，擦取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检。注意为保证多个检验项目的开展，同一病人应至少采集2支肛拭各类样品采集方法（3）•呕吐物：直接放入无菌容器中及时送检•咽拭样品：采集时应将棉签檫拭咽喉及扁桃体红肿处（特别是白膜处），然后将棉签插入4-5ml生理盐水中，尾部弃去•血液：采集患者急性发病期（3天内）和恢复期（2周左右）各3ml全血分离血清送检各类样品采集方法（4）•从业人员：据食物中毒的情况要求，可采取售货员或制作食品的工作人员及直接或间接接触食品的有关人员肛拭检样，特别对那些在事件发生前或现正患有肠炎、发烧、化脓性及可疑带菌者进行采样样品送检•检样采取后立即由专人在2小时内送区县疾病预防控制中心或（和）市疾病预防控制中心实验室检验•送检检样时，应附送采样送检申请单，并按要求注意冷藏•样品送检人员应与实验室收样或检验人员履行样品交接手续样品检验的能级分工•一般食源性细菌性突发事件由事件发生所在地区县疾控系统检验机构承担•重大食源性细菌性突发事件以事件发生所在地区县疾控系统检验机构承担为主，市疾控检验机构应共同参与检验工作•特大食源性细菌性突发事件由市疾控检验机构和事件发生所在地区县疾控系统检验机构组成的现场检验小组共同承担检验项目的分级•区县疾控系统检验机构应承担霍乱弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、沙门菌、变形杆菌、致泻性大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森菌、志贺菌、溶血性链球菌及单核细胞增生李斯特菌引起的食源性突发事件的样品检验检验项目的分级•市疾控检验机构除开展以上全部检验项目外，还需承担金黄色葡萄球菌肠毒素、各类致泻性大肠埃希菌毒素（或毒素基因）的测定以及区县疾控系统检验机构检出的霍乱弧菌、大肠埃希菌O157和疑难菌株的最终鉴定工作•在一般食源性细菌性突发事件和重大食源性细菌性突发事件的样品检验工作中市疾控检验机构应承担技术指导和质量控制的职责检验技术依据•GB4789-2003《食品卫生微生物检验》•GB17012-1997《感染性腹泻的诊断标准和处理原则》•WS/T8-1996《病原性大肠艾希氏菌食物中毒诊断标准及处理原则》、WS/T9-1996《变形杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》、WS/T13-1996《沙门氏菌食物中毒诊断标准及处理原则》、WS/T80-1996《葡萄球菌食物中毒诊断标准及处理原则》、WS/T81-1996《副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则》、WS/T82-1996《蜡样芽胞杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》细菌性食源性疾病的检验宗旨•竭尽全力尽快找到病原体•快速、准确•可与传统方法不一定完全相同•细菌性食源性疾病样品检验的一般程序•（附图2）检验程序1.样品采集↓2.初步检验→活菌数、直接镜检(涂片→染色→镜检)↓3.分离培养(包括增菌培养和直接平板培养)↓4.初筛试验↓5.纯培养↓6.全面鉴定直接涂片染色镜检•观察存在于检品中特种形态的细菌如霍乱弧菌、弯曲菌，为进一步的检验提供有用的信息一般活菌数的测定•按国标菌落总数测定方法进行，以了解可疑食品被污染情况检样的处理•非病源检样包括可疑食物、水样及环节样品等最好按1∶10的比例用胰大豆胨肉汤（TSB）37℃预增菌4～6h以保护和放大目的病原菌•病源检样因含较多病原菌而一般无须做预增菌处理，但若病源检样为服过抗生素后采集的或是从业人员带菌查源的检样应按检验项目要求而进行预增菌处理（直接插入2mlTSB管37℃预增菌4～6h）直接培养•将处理后的非病源检样及无须做增菌处理的病源检样按检验项目要求直接接种于各相应培养基增菌培养及接种•将预增菌处理后的非病源检样、服过抗生素后采集的病源检样及从业人员带菌查源的检样按检验项目要求接种各相应增菌液培养•增菌培养后接种于各相应培养基可疑菌落的选取常规分离培基及其菌落特征（附表3）初筛试验•克氏双糖/三糖铁/肠道综合发酵管1、管2•PCR•VIDAS可疑菌的鉴定•全面生化试验（API、ATB、VETIK、IDS、SWF、手工鉴定等）•噬菌体试验•血清分型•毒素或毒素基因测试毒素或毒素基因测试•霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、EIEC侵袭毒素、ETEC肠毒素按国标方法进行动物试验或酶联免疫试验（VIDAS等）•毒素基因测试：霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、致泻性大肠埃希菌的所有毒力基因均可用PCR检测，特别是对致泻性大肠埃希菌的定论应以毒素或毒素基因为准患者血清的试验•疑似伤寒或副伤寒的患者应取发病一周的血清做肥达氏反应，用作辅助诊断•将患者急性期和恢复期的血清做凝集效价的对比，4倍增长可确诊细菌性食源性疾病食品、水样、环节样品检验常规程序（附图3）细菌性食源性疾病食品、水样、环节样品检验推荐程序（附图4）细菌性食源性疾病人粪便、肛拭、呕吐物、咽拭样品检验推荐程序（附图5）检验结果的判定•应以找到病原体或其毒素为最终结论，在此之前所有的快速检验方法如PCR、VIDAS等得到的结果仅供参考•应注意非病源检样与病源检样检出的病原体的统一性检验结果的判定原则（1）•非病源检样与病源检样检出的致病意义明确的细菌在种类、生化和/或血清型、毒素型均一致时，可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体检验结果的判定原则（2）•非病源检样与病源检样只有一种检出病原菌时，此检验结果仅供临床与流行病学诊断参考，其中非病源检样的检验结果参考价值较大，病源检样只有在同次细菌性食源性疾病事件中的多数患者样品中检出种类、生化和/或血清型、毒素型均一致的病原体时才有参考价值检验结果的判定原则（3）•非病源检样与病源检样只有一种检出病原菌时，在与同一次细菌性食源性疾病事件中采集的多数患者的急性发病期和恢复期血清发生有凝集效价显著升高的，可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体，但此结果仅用作回顾性诊断检验结果的判定原则（4）•非病源检样与病源检样检出占绝对优势但通常致病意义不甚明确的细菌如大肠艾希菌、溶藻弧菌等，且其在种类、生化和/或血清型均一致，同时本次细菌性食源性疾病事件中非患者对照标本中未检出该菌时，应做该菌的毒素、毒素基因或动物试验，阳性结果可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体检验结果的判定原则（5）•样品中检出的生化、血清符合致泻性大肠艾希菌、金黄色葡萄球菌，一定要以毒素、毒素基因测试阳性为最终结论报告•蜡样芽胞杆菌在非病源检样中须达到105cfu/g(ml)以上者才有报告价值检验结果报告•检验技术人员应在收到食源性细菌性突发事件采样送检申请单后立即进行样品检验，并在5日内出具检验结果报告。特殊情况需延长出具检验报告时限的，应报相应卫生行政部门批准•一旦检验结果确定后，在检验报告还未完成前可先向有关部门电话报告检验结果•检验报告送达单位：市、区、县疾控中心实验室完成样品检验结果，将检验报告送达样品送检单位检验样品的处置•市、区、县疾控中心在未完成细菌性食源性疾病和食物中毒的样品检验工作前，所有采集的样品应在合适的条件下保存，其中对经检验确属阴性的或已经检测出病原菌并鉴定的样品完成检验报告后即可消毒销毁；对经检验为可疑的、暂时无法确认和需要复测的标本应予保留检出病原菌的保存•区县疾控中心完成对细菌性食源性疾病和食物中毒样品检验后，对检到的细菌性食源性疾病和食物中毒病原菌菌株应在3日内由专人送市疾控中心，由市疾控中心菌毒种保藏中心统一保存；•市疾控中心对细菌性食源性疾病和食物中毒标本中检到的病原菌，移交市疾控中心菌毒种保藏中心统一保存细菌检验重要筛检试验•接触酶试验•氧化酶试验氧化酶试验用于分辨G-杆菌中肠杆菌科及弧菌科两类细菌•革兰阴性杆菌阳性反应弧菌科阴性反应肠杆菌科接触酶试验用于分辨G+球菌中葡萄球菌及链球菌阳性反应葡萄球菌革兰阳性球菌阴性反应链球菌接触酶接触酶-+沙门菌检测概况•1880年发现，至今已有2600种•有动力（除鸡-雏沙门菌）•大多产H2S（除副甲伤寒沙门菌等）•产酸大多产气（除伤寒、鸡-雏沙门菌）•靛基质-、蔗糖-、乳糖-•甘露醇+•符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原+、氧化酶-）沙门菌的初筛肠道综合发酵管1：甘露醇（上斜面）+葡萄糖（下直面）+产气肠道综合发酵管2：蔗糖-、动力+、H2S+、靛基质-血清凝集（1）•A-F多价+•O•H1•H2血清凝集（2）若生化反应符合，而血清A-F多价-，考虑：•Vi抗原（伤寒、副丙伤寒沙门菌）遮蔽，煮沸后再凝•亚利桑那菌：迟缓发酵乳糖，延长Mac平板培养时间至4天•可能是A-F以外的沙门菌：如O39：Hb，2旺次渥沙门菌在上海地区多见•极可能是柠檬酸杆菌报告方式•A群甲型副伤寒沙门菌1,2,12:a•B群乙型副伤寒沙门菌1,4,5,12:b:1,2•鼠伤寒沙门氏菌1,4,5,12:i:1,2•C群丙型副伤寒沙门菌6,7,vi:c:1,5•猪霍乱沙门菌6,7,:c:1,5•D群肠炎沙门菌1,9,12:g,m•伤寒沙门菌1,9,vi:d•鸡雏沙门菌1,9,12:-志贺菌检测概况至今已有4群（A、B、C、D）、32种（A-痢疾志贺菌10个血清型；B–福氏志贺菌6个血清型+X、Y变种；C-鲍氏志贺菌15个血清型、D-宋内1个血清型，S，R两相）无动力乳糖-（除宋内迟缓发酵+）不产H2S产酸