涂布平板法

涂布平板法实验器材牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制牛肉膏0.3g蛋白胨1g氯化钠0.5g琼脂2g自来水100mLpH7.0～7.2灭菌1.05kg/cm2，22min配制具体步骤1．称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。很多都是不需要过滤的。5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6．加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。7．包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8．灭菌将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）菌剂。2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。四、实验方法1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。图22-1平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。2．平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。（1）混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。（2）涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。回答人的补充2009-11-0923:10三、实验器材1．活材料：你的材料2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。提问人的追问2009-11-1017:16还有关于高氏一号、马丁氏的吗？求解..万分感谢回答人的补充2009-11-1018:17高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基是由可溶性淀粉（作为碳源），KNO3（作为氮源），NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O（作为无机盐，为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫等离子）和FeSO4·7H2O（作为微生物的微量元素，提供铁离子）等组成。由于磷酸盐和镁盐相混合时产生沉淀，因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。对于象FeSO4·7H2O这样的微量成分，则可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时按需要加入一定的量。高氏1号培养基配方如下：可溶性淀粉20gNaCl0．5gKNO31gK2HPO4·3H2O0．5gMgSO4·7H2O0．5gFeSO4·7H2O0．01g琼脂15—20g水1000mlpH7．4—7．6三、器材可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5．5—9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。四、操作步骤1．称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0．01g/ml，再在1000ml培养基中加入1ml的0．01g/ml的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，RoseBengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。马丁氏培养基配方如下：KH2PO41gMgSO4·7H2O0．5g蛋白胨5g葡萄糖10g琼脂15－20g用蒸馏水定容至1000ml此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3．3ml。由于链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液，在100ml培养基中加1%链霉素液0．3ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。后面的步骤都是差不多的。像这些培养微生物的方法，只是在培养基的培制上有一点区别，其它方面都是差不多的。