生物化学检验

概述生物化学检验是以健康和疾病时的生物化学过程为研究目的，通过测定组织、体液的成分，揭示疾病变化和药物治疗对机体生物化学过程和组织、体液成分的影响，以提供疾病诊断、病情监测、药物疗效、预后判断和疾病预防等有用信息的一门学科。常用的生物化学检验技术在临床生检验和临床生化科研中常应用多种分析技术、包括光谱分析技术、电化学分析技术、电泳分析技术、层析和离心分析技术及自动化分析技术等，其中光谱分析技术是最基本和最常用的，它具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好和不破坏等特点而被广泛应用，生化分析仪采用的就是光谱技术中的吸收光谱法和比浊法。吸收光谱法吸光度的定义一束强度为Io的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收池时，如下图，一些光被吸收，光强从Io衰减为It，则该溶液的吸光度（A）等于：A=-lgIt/Io其中It/Io称为透光度（T），所以A=-lgT=lgIo/It吸收曲线波长从200nm-400nm的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测定灵敏度。Lamber-Beer定律（A=εCL）Lamber-Beer(朗伯—比耳)定律的意义为：某溶液的吸光度等于该物质的吸光系数ε、浓度C和光径L(cm)的乘积，当光径不变时，浓度和吸光度成正比，这是生化分析仪利用吸收光谱法进行定量测定的基础，见下图：前提条件：(1)被吸收光为单色平行光，(2)待测定溶液为稀溶液吸收光谱法在生化分析仪上的应用除特种蛋白外的大部分临床生化项目，配以相应的试剂，均可利用吸收光谱法在生化分析仪上进行测定。如酶类：包括ALT，AST，ALP，ACP，r-GT，α-HBDH，LDH，CK，CK-MB,α-AMY等。底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA，UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2等。无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl等。比浊法分类比浊法分两类：透射比浊法和散射比浊法。带有小粒的悬浮液和胶体溶液都具有向四面八方散射入射光的性质，当一束平行光通过含有悬浮质点的悬浮液或胶体溶液时，同时受到散射和吸收两个因素的影响，使光的强度减弱。在光源的光路方向上测量透射光(实际上还包括散射光)强度与入射光强度的比值，并通过该比值测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶度，称为透射比浊法，在光路的其他方向上测定测量散射光强度，从而测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶度，称为散射比浊法。1)透射比浊法原理：一束强度为的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小与光源波长接近)的悬浮液或胶体溶液时，如下图，其透射光强度I可用下式表示：I=Ioe−τLL为悬浮液或胶体溶液在光前进方向上的长度，τ为浊度系数，与悬浮质点的浓度C成线性关系。令τ=2.3KC，则：lgIo/I=KCL该式与Lamber-Beer定律相似，这是生化分析仪利用透射比浊法进行定量测定的基础。2)散射比浊法原理：一束强度为Io的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小远小于光源波长)的悬浮液或胶体溶液时，如下图，与入射光垂直方向上，其散射光强度I可用下式表示：式中，n1、n2分别表示质点与介质的折射率，ν表示单位体积内的质点数，r表示质点半径。可见散射光强度与悬浮质点的浓度成正比，这是利用散射比浊法进行定量测定的基础。比浊法在生化分析仪上的应用透射比浊法可以与吸收光谱法共用一个检测器，所有生化分析仪，不需增加任何部件，均可利用此法进行测定。大部分特种蛋白，如载脂蛋白(apoAI,apoB等)、补体类(C3、C4等)、免疫球蛋白类(IgA，IgG，IgM等)等，配以相应的试剂，可利用此法在生化分析仪上进行测定。散射比浊法因另需在光路垂直方向上增加一检测器，目前只有极少数生化分析仪可利用散射比浊法进行定量测定，而几乎所有的特种蛋白分析仪、免疫分析仪等都能利用散射比浊法进行定量测定。自动生化分析方法的分类概述自动分析方法首先是基于常规实验室的基本方法，如终点法和连续监测法。由于自动生化仪使用了高新技术，使这些方法得到了扩展。终点法包括单波长和双波长终点法、比色法和比浊法，一点终点法和两点终点法。连续监测法可分为速率A、速率B、两点速率，也可选择双波长。校正方法有多点线性校正、非线的对数校正和量程法。一、终点法定义：终点法是实验室常用的方法之一。它是反应混合物经过一定时间反应后，达到平衡（终点），即在呈色反应稳定阶段时，检测其颜色对光的吸收强度，以此计算待测物的浓度。终点法可分为一点终点法和两点终点法。一点终点法一点终点是使用一种或两种试剂，当样品和试剂混合后，待测物与试剂的物理化学反应达到终点时，测定一次吸光度，计算待测物的浓度。该法具有代表性的试验有：总蛋白、清蛋白、葡萄糖氧化酶等。如图所示：t1时刻加入试剂（体积为V），t2时刻加入样本（体积为S），然后搅拌并反应，之后测量反应液的吸光度，在t3时刻反应达到终点；t3-t2为测定时间。两点终点法两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原理是：加入样品→试剂1→读取A1→试剂2→读取A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB等)、补体类(C3、C4等)、免疫球蛋白类(IgA，IgG，IgM等)以及药物监测等。双试剂单波长t1时刻加入第一试剂(体积为V1)，t2时刻加入样本(体积为S)，之后搅拌，t3时刻加入第二试剂(体积为V2)并立即搅拌，t4时刻反应达到终点。t3-t2为孵育时间,t4-t3为测定时间。二、连续监测法连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1）绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力（U/L）=〔△A（测定）/△A（标准）〕标准物的活力或浓度。三、双波长法双波长法不仅适用于终点法，也可用于动态监测法（连续监测法）。其原理是：检测器在对待测物进行检测时，同时用两个波长进行检测，用主波长的吸光度减去副波长的吸光度，标准物（校准品或标准品等）与待测物同等对待，计算待测物的浓度。优点是可以消除背景吸收，而减少样品的颜色和浊度所产生的影响，它不仅可以有效地校准样品的混浊、溶血、黄疸等，还可以对电源波动有补偿效果。这种方法是较新型全自动生化分析仪的特点之一。生化试剂从二十世纪四五十年代开始产生第一代生化试剂开始，生化试剂得到了迅速的发展，从手工配置到大工业化生产，从单一的几个项目发展到现在七十多个项目，以及各种封装形式的出现，生化试剂在测试项目，测试反应的特异性、试剂的稳定性、测试结果的重复性和准确性、测试的线性范围等方面都发生的质的变化，而且这种发展现在仍然在迅猛的进行中。临床生化试剂的发展历史第一阶段：各医院实验室通常自行配制简单试剂，能开展的生化检测的方法及检测项目十分有限，无统一标准，准确性极差。第二阶段：使用时要用多种试剂配制在一起，稳定性很差，多数在冰箱内只能保存数天，并且操作繁琐费时，容易加错试剂。第三阶段：冻干试剂、干粉试剂。冻干试剂是先将各种化学试剂溶解混合后，分装成不同试剂的瓶内，再经冻干处理。冻干试剂中残留的含水量不易精确控制，造成瓶间差较大。干粉试剂是用将各种干燥的化学试剂直接混合加工而成，各瓶内试剂中所含水量均一。冻干和干粉试剂在用前要复溶，复溶时对水质及其加入量要求很高，复溶后保存期短，稳定性差，常常造成浪费，同时不能抗干扰。第四阶段：液体双生化试剂。准确、稳定性好；抗干扰能力强，无需复溶，使用方便，不易浪费，使用前无需准备，可直接上机使用，并适用于手工法。双试剂的定义双试剂是指将反应体系的全部试剂分成两大组分，即第一试剂先与被检样本中的干扰物质反应，使其被扣除，然后加入第二试剂，样本中的被检物质与反应体系中的试剂起反应，再进行测定。双试剂的优点1）抗干扰反应能力强在临床生化测定过程中，血标本本身成分十分复杂，除了含有待测物质外，还含有各种酶、有机物、无机盐等物质，这些物质都会干扰或参与测试反应，引起非特异性干扰反应。为了克服这种干扰反应，将试剂盒分为两组，在测定过程中，试剂1与标本中的干扰物反应，使其消耗，再用试剂2启动真正的测试反应进行测定。2）增强了工作试剂的稳定性许多酶法测定试剂盒为冷冻干燥试剂，在4℃保存一般稳定期在1年以上。但复溶后的工作试剂的稳定性差，如ALT测定工作试剂4℃只能保存一周，AST测定工作试剂4℃只可保存四天，而液体双试剂则使稳定性大大延长，如ALT、AST测定的液体双试剂在4℃可稳定一年。液体酶法试剂从配制上解决了这一矛盾：a．用户可根据每次标本量按一定比例配制适量工作液，当天配制当天用完这样便可减少试剂损失b．如果用户使用的自动生化分析仪有双试剂测定功能，那么，就不必把双试剂混合成工作试剂进行测定，试剂的有效期一年便是工作液的有效期。c．对于干粉、片剂型等需复溶的生化试剂，水质的好坏直接影响了复溶后工作液的稳定性和测定重复性。目前除了一些三级医院有自制的试剂级的蒸馏水外，其他医院很难获得符合试剂级要求的水，这就对干粉、片剂试剂的实际使用造成了一定的影响。3）提高了测定结果的重复性试剂组分的高度均一性，提高了测定结果的重复性，避免了瓶间差，试剂中每一组分均一性是影响测定重复性的一个重要因素。生化试剂产品分类1.肝功能系列：ALT,ALP,AST,CHE、TB,PA.等2.血脂系列:TG,LP（a）,HDL-C,LDC,ApoA1,ApoB3.糖代谢系列:GLU,GSP,HbAIC等4.肾功能系列:BUN,UA,CRE等5.心肌酶系列:CK,CK-MB,LDH,ADA等6.胰腺系列:AMY7.特种蛋白系列:CRP,RF,ASO,(PA),免疫球蛋白8.微量原素系列：Ca，P,Mg，CO2等血脂系列血脂：是指血浆中的甘油三酯（TG）和胆固醇(TC)及类脂（磷脂、糖脂、固醇、类固醇）的总称，血脂广泛存在于人体中，它们是生命细胞基础代谢的必需物质。脂蛋白：由于甘油三酯和胆固醇都是疏水性物质，不能直接在血液中被转运，同时也不能直接进入组织细胞中。它们必须与血液中的特殊蛋白质和极性类脂(如磷脂)一起组成一个亲水性的球状巨分子，才能在血液中被运输，并进入组织细胞。这种球状巨分子复合物就称作脂蛋白。载脂蛋白:脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白,具有结合与转运脂质及稳定脂蛋白结构等功能.血桨脂蛋白的分类（超速离心方法）分类CMVLDLLDLHDL密度＜0.950.95-1.0061.006-1.0631.063-1.210载脂蛋白含量(%)ApoB48(9)ApoB100(20-60)ApoB100(95)ApoAⅠ(65-70)合成部位小肠粘膜细胞肝细胞血桨肝,肠,血桨功能转运外源性甘油三脂和胆固醇转运内源性甘油三脂和胆固醇转运内源性胆固醇逆向转运胆固醇载脂蛋白的分类目前已报道的载脂蛋白有二十余种，而临床意义较为重要且认识比较清楚的有ApoAI、Ap