人类常见肿瘤新鲜组织标本采集

《人类常见肿瘤新鲜组织标本采集、处理和保存的技术规程》1．为保护、保存并充分利用人类肿瘤遗传资源，提高我国肿瘤防治水平，特制定本规程。2．本规程严格遵守1998年由国务院颁布的《人类遗传资源管理暂行办法》并以此为基准。3．人类常见肿瘤新鲜组织标本的采集包括收集来自肺、食管、大肠、乳腺、肝、胃、甲状腺、肾等脏器肿瘤患者的标本，包括其血液或血液成分、各种体液如尿液、痰液或精液等标本的采集。（注：血液标本的收集附后）4．全部标本贮存于人类常见肿瘤新鲜组织库（简称“组织库”），该组织库必需由专人长期负责。5．组织库至少设立主任一名，负责组织库的管理、协调及组织标本的使用权限等事务。其他至少需要固定取材人员一名、信息登记人员一名，材料准备人员一名。6．人类常见肿瘤新鲜组织标本的取材前准备工作：6.1所有组织标本的取材均需事先向患者及/或家属详细解释，征得患者及/或家属的同意后签署《知情同意书》。6.2标本采集一般在手术室、腔镜室进行，必需得到相关管理人员的许可，同时争取得到相关人员的积极配合以保证标本的及时获得。7．人类常见肿瘤采集步骤7.1准备工作：主要设备包括剪刀2把、镊子2把、刀片若干、生理盐水、不同颜色的冻存管、临时登记本、标记笔、标签纸、液氮及便携式标本贮藏罐；-86℃深低温冰柜；高温高压消毒灭菌手术器械与贮藏管；电动组织匀浆器；低温高速离心机；紫外分光光度计；制冰机；Trizol试剂盒。7.2标本选择：选取的标本包括肿瘤组织、正常组织和(或)癌旁组织。7.3标本切取的方法与时机：首先进行大体标本的观察或拍照，确认肿瘤的部位、范围，注意与周围组织及坏死组织的鉴别，在标本离体后应在最短的时间内切取标本(30min)，将癌及癌旁组织切取成多块直径为0.5cm左右的组织块，分别装入已编号的灭菌冻存管中，迅速放入液氮转移罐并做好长期保存准备。8．人类常见肿瘤标本的保存方法：7.1尽快将液氮转移罐中的标本转移入标本盒中，标本盒每装满一盒，即在盒上注明其内存放标本的开始与结束编号。7.2标本盒长期存放在-86℃深低温冰箱中保存。7.3标本相关资料的登记：标本存放好后，及时进行标本相关资料的登记工作，标本相关资料的登记内容包括标本编号、姓名、住院号、肿瘤类型、取材数量（分别用T和N代表肿瘤及正常，T及N后面的数字表示取材份数，如T3代表肿瘤标本3份，N2代表远癌正常标本2份）、离体时间(分钟)、组织质量（A＝无明显坏死、B＝散在坏死、钙化，C＝大量坏死）。示例：编号姓名住院号肿瘤类型取材数量离体时间组织质量353***123456肺癌T4N425minA9．人类常见肿瘤新鲜组织库信息化管理平台的建立：采用统一设计的信息管理系统应用于肿瘤库的管理，系统运行平台为WindowsXP，数据库为EXEL或ACCESS2003。系统功能内容包括：9.1患者基本信息：姓名、性别、年龄、职业、随访联系方式、住院号、既往史、手术史、有无放化疗、手术日期、手术名称、手术性质、切除部位、病理诊断（包括分化程度及组织学类型）、TNM分期、手术并发症、有无手术死亡、最后一次随访时间、生存时间、死亡时间、死亡原因及其它。如下图所示。9.2标本信息录入：包括入库编号、入库类别、病变部位、组织部位、保存方式、收集人、入库时间、离体时间、标本质量。9.3标本存放位置信息：入库编号、存放设备、标本盒规格、标本数量、计量单位、存放位置坐标等。10．标本使用管理：10.1使用登记：出库编号、出库日期、入库编号、标本原始位置、使用单位、使用人、审批单位、审批人、经手人等；10.2实验信息录入：入库编号、实验号、实验内容、实验结果、实验单位、实验人、实验日期等。11．标本废除管理：废除编号、人库编号、标本原始位置、废除日期、废除原因、审批人等。12．系统管理：包括用户管理、术语维护、标本盒管理等。13．标本的收集、保存、使用实行专人管理。管理人员严格按照肿瘤库制定的标本出入库及保存质量进行标准化管理。定期检查液氮、冰箱的工作状态及性能。发现问题及时处理。14．标本使用需申请，经组织库负责人审批后方可使用。15．随机取库存标本作光镜检查、抽提核酸，了解保存质量。16．组织标本的质量鉴定16.1病理组织学鉴定：利用常规病理学检测方法进行病理组织学鉴定。16.2组织总RNA鉴定：参照Trizol试剂盒操作指南进行组织总RNA的提取，紫外分光光度计测定经稀释的RNA提取物的A值，并根据测定时RNA提取物稀释比例换算提取物浓度，计算方法为测定浓度×稀释倍数或A260测定值×稀释倍数×40ug／ml，判断RNA纯度标准为A260／A280，大于1.6；l％琼脂糖凝胶电泳检查RNA提取物的完整性，即应显示明显的28s和18s条带，而且28s的亮度大约是l8s的2倍。附：常见肿瘤患者血液样本收集和管理1．样本收集肿瘤患者入院后，于手术前1日手术配血时同时抽取5ml空腹静脉血，置与EDTAK3抗凝管中，当日上午由组织库专门人员收集，并进行白细胞及血浆分离处理。要求白细胞样品在取血样120min内完成分离，分离的血浆在液氮中速冻后-86˚C冷冻保存。2.材料2.1专用取血管2.2淋巴细胞分离液2.3灭菌生理盐水（普通0.9%生理盐水灭菌即可）2.4Trizol试剂3.流程（以4ml血为例）将4ml抗凝血，以3,500转/分，室温，离心10分钟。将会看到血液分为2层，上层是淡黄色的血浆，约占60％↓将上层血浆吸出，分装成两管，1ml/管↓液氮中速冻30min后，-80˚C冷冻保存↓还剩约2ml血细胞层，在血细胞层中加入1：1体积，即约2ml的灭菌生理盐水，混匀↓将8ml淋巴细胞分离液（是全血体积的2倍）预先加入灭菌的离心管中。将与生理盐水混合的血细胞缓慢加入淋巴细胞分离液液面上，注意尽量不要让血细胞层掺入到淋巴细胞分离液层去↓以1500转/分，室温，离心20分钟(离心机要求水平转头)↓可以看到液体分为三层，上层是淡黄色的血浆，中间一层乳白色，最下面一层是红色的血细胞。在中间层和上层交界处是有一层白色的膜，即白细胞层，（同时在明显的白细胞层下面有较厚的乳白层液体，此层液体中也含有白细胞，但量较少，若血液足够，可以考虑不要此层，若白细胞层不很明显而乳白色液体层太厚，可以2500转/分，继续离心10分钟以加强白细胞的分离效果）↓用巴士滴管或移液器收集界面上的白细胞层↓放入灭菌的1.5mlEP离心管中↓以10,000转/分，室温，离心5分钟，吸掉上清，可见白色的沉淀，有时白色的沉淀上还混有红色的血细胞（少量红细胞无妨）↓-86˚C冰箱保存。