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常见内分泌遗传病的基因检测一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。单基因病：–Thalassemias(地中海贫血)–DMD(假肥大型肌营养不良)多基因病–高血压染色体病–染色体数目/结构改变Trisomy21DownsyndromeTrisomy18EdwardsyndromeTrisomy13Plateausyndrome47,XXYKlinefeltersyndrome45,XTurnersyndrome69,XXXYAbortus–异位(平衡/不平衡)体细胞病–体细胞遗传物质的改变，癌。–视网膜母细胞瘤线粒体基因病由于线粒体DNA（mtDNA）上的基因突变所致的遗传病，呈母系遗传，如MELAS。一、遗传与人类疾病单基因遗传病的遗传方式常染色体显性–SCA1,SCA2,SCA3,…常染色体隐性–SRD5A2,CYP21A2…X-连锁显性–Rett综合征(RETTsyndrome)X-连锁隐性–雄激素不敏感综合征(androgeninsensitivitysyndrome)Y-连锁–Y连锁遗传性耳聋(Y-linkedhereditaryhearingimpairment)线粒体–母系遗传：线粒体病(MELAS,MERRF,etc.)染色体与基因基因组成一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录疾病概述•出生缺陷的危害•死亡率大幅升高•导致儿童和成人残疾•给本人、家庭造成极大的不幸，带来极为沉重的社会和经济负担，将有碍于提高人口素质。9.12中国预防出生缺陷日二、为什么要建立基因检测？疾病概述–遗传因素–环境因素–或二者的共同作用出生缺陷的发生原因疾病概述出生缺陷预防措施疾病概述降低出生缺陷的武器基因检测的意义1：---有效的遗传咨询，降低出生缺陷确诊遗传咨询产前诊断基因检测的意义2：---指导治疗•肿瘤的个体化治疗•预防：药物性致聋•可治性/部分可治性遗传病–遗传代谢病：PKU，希特林蛋白缺乏症，伴有高同型半胱氨酸血症MMA–肝豆状核变性，低钾性周期性瘫痪，原发性震颤–发作性非运动诱发性运动障碍–原发性肌张力障碍–先天性肌强直•手术治疗–原发性高草酸尿症–神经纤维瘤–结节硬化症一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录遗传病检查基因突变蛋白质改变代谢异常临床表现基因检测酶活性测定质谱检测临床诊断微小突变拷贝数变异复杂变异DMD多巴反应性肌张力障碍肝豆状核变性脂质沉积性肌病脆性Ｘ综合征遗传共济失调亨廷顿病FSHDOPMDPWS综合征Angelman地贫Downsyndrome如何检测基因突变？遗传病都是从基因突变开始的基因检测的目的与策略•目的1：有无突变？–策略1：直接检测突变–策略2：连锁分析–间接检测有无携带突变•目的2：何种突变？–策略：直接检测突变突变类型方法举例微小突变错义/无义突变剪接突变调控区序列突变小缺失/插入基因测序(Sanger测序、二代测序NGS)熔点曲线…地贫血友病乙肝病毒…拷贝数变异简单拷贝复杂拷贝定量PCR/片段分析PCR;TP-PCR;TP-msPCR;msPCR强直性肌营养不良肯尼迪病…大片段插入/缺失连接酶依赖性探针扩增（MLPA技术）SouthernblotFISHaCGH假肥大型肌营养不良脊肌萎缩症复杂的重排长片段PCR血友病表观遗传变异msPCR;ms-MLPA天使综合征基因检测方法直接诊断策略--直接检测基因的各种突变微小突变（“点突变”）第一代(Sanger)测序苯丙酮尿症甲基丙二酸血症肝豆状核变性拷贝数变异片段分析Southernblot脆性Ｘ综合征遗传共济失调亨廷顿病FSHD复杂变异MLPAFISHPWS综合征地贫下一代测序NGS基因芯片CMA高级的诊断技术--CMA和NGS测序“高密度，灵活定制，微量样品”数千美元测定全基因组间接诊断策略--多态性连锁分析、关联分析连锁分析例子•间接诊断–基因尚未被定位或阐明–找不到突变–产前诊断•多态性连锁分析–寻找具有基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等，并判断受检者是否存在。CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!选择哪种技术，要看具体想解决的问题一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录经典的直接测序方法，基因突变检测的“金标准”；主要检测微小的基因突变（包括点突变、微小缺失或重复）；仅适用于单基因遗传病检测，无法检测多基因遗传病；常用的基因检测技术平台及特点3、一代测序：Sanger测序1、多重连接酶依赖性探针扩增技术（MLPA）探针与靶序列DNA进行杂交，通过探针的特异化连接、PCR扩增，收集数据并进行分析；可应用于缺失、重复突变检测；2、基于PCR的片段分析技术以PCR技术为基础；主要检测动态突变（指DNA中的核苷酸（主要为三核苷酸）重复序列的拷贝数发生扩增而产生的突变）；4、下代测序/高通量测序(NGS)：革命性技术发展对传统测序一次革命性的改变，通过边合成边测序，一次可并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定；可对多个基因共同作用引起遗传病进行测度检测，能更好、更快确诊各种遗传病；主流平台：Roche454焦磷酸测序；IlluminaSolexa合成测序；ABISOLiD连接法测序；疾病概述（一）MLPA技术介绍•原理：利用可与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和定量分析。•MLPA的典型特点是，它不是扩增靶序列，而是扩增与靶序列结合的MLPA探针。MLPA技术特点MLPA应用范围染色体异常（数目、重排、染色体亚端粒区域的基因拷贝数变化）遗传疾病基因缺失、重复分析单核苷酸多态性(SNP)和突变检测基因甲基化检测肿瘤诊断与治疗方面的应用mRNA研究等案例一（二）片段分析技术动态突变：•动态突变是指DNA中的核苷酸（主要为三核苷酸）重复序列的拷贝数发生扩增而产生的突变。动态突变伴随着世代的传递而不断扩增，重复序列的拷贝数越来越多，在达到一定的倍数后就导致疾病的发生，其发病率和疾病的严重性也逐代升高加重。•eg:脆性X综合征是由FMR1基因（Xq27.3）的CGG重复数扩增而引起的，正常人重复数为6~45次，前突变为55-200，全突变则200次。需联合应用std-PCR及TP-PCR技术诊断脆性X综合征。特殊PCR方法std-PCR原理由正反向引物扩增包含了重复序列的目的片段，检测目的片段的长度，从而计算出重复区的重复次数。TP-PCR原理PCR的反向引物被设计与致病基因的重复序列进行杂交。各种大小不一的序列在三重PCR反应中被扩增出来。如果重复数量增加了，一个明显的PCR产物轮廓（梯形轮廓）会在峰图中出现。片段分析主要适用项目（动态突变）•SCA（脊髓小脑共济失调）•FRDA（Friedreich共济失调）•HD（亨廷顿舞蹈病）•KD（肯尼迪病）•DM（强直性肌营养不良）•FraX（脆性X综合征）•SCA3片段分析（三）Sanger测序•确定一条染色体片断上的碱基顺序。•Sanger法：–在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）–ddX的两个作用：•可以当作正常碱基参与复制•一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接–电泳–谁终止，碱基就是谁–此方法获1974年的Nobel奖分析流程记录SNP编号和命名是否突变命名查数据库错义突变Polyphen预测非编码区同义突变剪接位点预测Google查询图形质量判断查SNP位点合格结果解释测序图形数据分析BTD基因测序结果父亲患儿母亲c.637delCc.1387TGc.1387TGc.637delC正常型正常型（四）高通量测序高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation”sequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。NGS主流平台包括Roche454焦磷酸测序、IlluminaSolexa合成测序、ABISOLiD连接法测序、单分子测序技术以及由lifetechlogies公司推出的IonTorrentPGM（PersonalGenomeMachine个体化操作基因组测序仪）半导体测序技术。传统的分子遗传检测•一个项目检测一种疾病•某些复杂遗传病十分复杂，十分难以有效检测：–ALS–智力障碍–肢带型肌营养不良酶学分析粘多糖症脑白质病-ASAKrabbe病肌肉病理LGMD免疫组化染色体与分子生化与酶学形态分子通量↑检测能力↑Life:IontorrentPGM;IonprotonIlluminamiseq高通量测序平台nextseq500•由Illumina开发，TruSightOneSequencingPanel全面覆盖4,813个与临床表型相关的基因。实验室可分析panel上的全部基因，或有选择地关注特定亚群。通过这种方式，单个panel可有效代表整个新一代测序组合。Illuminamiseq一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录金域检验基因检测项目介绍针对疾病遗传物质变异方式：多种检测平台整合针对临床不同检测需求：单一项目和套餐项目设置疑难遗传病基因检测方案适用情况：临床已排除常见病因，高度怀疑是遗传病，但是患者症状不典型或者症状设计多个系统，临床无法明确诊断，仅怀疑为遗传病解决方案：金域能根据临床提供患者症状和病例，选择与疾病相关基因进行检测，提供个性化检测服务常见遗传病基因检测方案适用情况：患者症状典型，临床能明确诊断疾病类型或者具体疾病亚型，如腓骨肌萎缩病或者腓骨肌萎缩病1型等解决方案：金域可针对临床诊断进行相关基因检测常见遗传病基因检测系列列表骨骼肌基因基因检测系列线粒体相关基因检测系列周围神经疾病基因检测系列神经系统先天畸形基因检测系列阿兹海默症基因检测系列神经皮肤综合征基因检测系列遗传性共济失调基因检测系列微量元素与金属代谢障碍基因检测系列智力发育障碍基因检测系列遗传代谢病基因检测系列癫痫基因检测系列………………..临床仅能判断为遗传病无法明确为哪种遗传病可送检疑难遗传病基因检测项目，一次检测与临床表现相关的基因临床能明确为哪种遗传代谢病，如能判断为糖原累积症，但是无法明确为糖原累积症的哪种亚型临床可送检糖原累积症整体检测项目，一次检测与糖原累积症相关基因临床能具体诊断为哪种疾病，如能明确为21羟化酶缺乏症临床可送检CYP21A2基因检测项目（MLPA检测、测序）基因检测送检流程——临床送检思路基因检测流程步骤采样对象说明申请-申请人、医生签署《知情同意书》、收费。为便于实验室与临床医生交流，希望医生留电话号码和e-mail。先证者检测先证者先证者父母通常先证者的样本都是必须的。当先证者的样本无法获得时，也可以检测肯定携带者。例如，X连锁隐性遗传