鲎试剂灵敏度复核试验

文件编号：版本：鲎试剂灵敏度复核试验作业指导书修订历史记录[至多存五版的历史修订记录]版本发行日期文件更改申请编号修改内容|1.0目的对细菌内毒素检查试验所用的鲎试剂的灵敏度进行复核。2.0职责质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。3.0范围适用于本公司细菌内毒素检查法。4.0参考文件2010年版《中国药典》二部附录ⅪE细菌内毒素检查法2010年版《中国药品检验标准操作规范》细菌内毒素检查法《细菌内毒素检查法及其应用》第一版，气象出版社5.0定义鲎试剂灵敏度复核试验：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度（λ），用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。反应终点浓度：指鲎试剂灵敏度复核试验中，系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。6.0设备/工具及物料6.1设备/工具6.2物料6.2.1细菌内毒素工作标准品除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。设备/工具数显恒温水浴箱电热恒温水浴锅电热干燥箱混匀器水银温度计可调式移液器无热原安瓿无热原吸嘴试管架砂轮封口膜|6.2.2细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。6.2.3鲎试剂规格一般选用0.25EU/ml。7.0操作步骤7.1提前30min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完毕后用75%乙醇擦拭超净工作台。试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。7.2制备细菌内毒素标准溶液7.2.1取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部划痕，用75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。7.2.2按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。封口膜封口，置漩涡混合器上混匀15min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。注：在使用过程中，标准品溶液若静置超10min，必须重新混匀30s再重新使用。7.2.3试验举例设细菌内毒素工作标准品为100EU/支；待测鲎试剂λ=0.25EU/ml。稀释过程如下：取细菌内毒素标准品100EU/支+1ml检查用水100EU/ml取0.2ml100EU/ml溶液+1.8ml检查用水10EU/ml取0.2ml10EU/ml溶液+1.8ml检查用水1EU/ml取0.9ml1EU/ml溶液+0.9ml检查用水0.5EU/ml取0.9ml0.5EU/ml溶液+0.9ml检查用水0.25EU/ml取0.9ml0.25EU/ml溶液+0.9ml检查用水0.125EU/ml取0.9ml0.125EU/ml溶液+0.9ml检查用水0.0625EU/ml即得2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。7.3溶解鲎试剂7.3.1取0.1ml装量的鲎试剂18支，安瓿开启过程同6.2.1工作标准品。7.3.2每支鲎试剂加入0.1ml细菌内毒素检查用水溶解，在试管架上按下面的形状排列。注：在复溶鲎试剂时，应使用可调式移液器连接无热原吸嘴加样，而不是使用移液管加样。鲎试剂复溶后不能放到漩涡混合器上去混合，因为强烈混合容易使复溶后的鲎试剂产生泡沫，影响凝胶的形成。实际上只需将鲎试剂复溶后静置1~2分钟鲎试剂就可变澄清。7.4加样（鲎试剂安瓿排列如下图）|512345第1列每支加入2.0λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1ml第2列每支加入1.0λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1ml第3列每支加入0.5λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1ml第4列每支加入0.25λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1ml第5列每支加入细菌内毒素检查用水0.1ml，作为阴性对照注：每次加样浓度必须是从高到低，加不同浓度的样品需更换新的移液器吸嘴。7.5加样结束后，用封口膜封口，将鲎试剂安瓿中溶液轻轻混匀，应避免产生气泡，连同试管架垂直放入37℃±1℃的恒温水浴箱中，试管架保持水平状态，保温60min±2min。使用温度计监测恒温水浴箱温度是否满足实验要求，每30分钟进行温度记录，记录表格参见。7.6判断及计算7.6.1将鲎试剂安瓿从恒温水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性“＋”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑落者为阴性“－”。注：保温和拿取鲎试剂安瓿的过程应避免受到振动造成假阴性结果。7.6.2当最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。7.6.3按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1（ΣX/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，方可用于干扰试验和供应品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。7.6.4试验举例如果待复核的鲎试剂的标示灵敏度为0.25EU/ml，试验结果如下：|内毒素标准溶液浓度（EU/ml）2.0λ（0.5）1.0λ（0.25）0.5λ（0.125）0.25λ（0.0625）阴性对照反应终点浓度（EU/ml）重复管数1++---0.252++---0.253+++-空0.1254++--空0.25则鲎试剂灵敏度的测定值λc=lg-1（ΣX/4）=lg-1[(lg0.25+lg0.25+lg0.125+lg0.25)/4]=0.21EU/ml结果λc在0.5λ~2.0λ范围内，符合规定。以标示灵敏度0.25EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度λ。8.0记录和表格设备温度记录表鲎试剂灵敏度复核试验报告注：在细菌内毒素测试报告中填写复核数据、复核结果、日期、检测人签名等相关内容。