高效液相色谱培训教案

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography青海大学分析测试中心李德英第一章绪论第二章高效液相色谱基本概念第三章高效液相色谱仪构成介绍第四章高效液相色谱方法及原理第五章高效液相色谱方法的建立及应用第一章绪论第一节高效液相色谱的特点第二节高效液相色谱的分类第三节高效液相色谱的应用范围和局限性第一节高效液相色谱的特点高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间很长，因而未受到重视。20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。因此，在20世纪60年代后，高效液相色谱技术才有了很快的发展。高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）还可称为高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）或现代液相色谱（modernliquidchromatography）。1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立植物色素分离见图示2、20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。3、30～40年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、吸附色谱和电泳领域取得了成果※5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱※6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求一、色谱法（chromatograph）的起源和发展图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚植物色素混合物7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领域。8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品化的离子色谱仪问世。9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪。10、20世纪80年代以后，一种新型的色谱技术—毛细管电泳技术随之出现。11、20世纪90年代以后，ELSD一种新型的检测器出现，改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。12、20世纪90年代中期以后，用于HPLC的MS检测器开始普及，使液相进入定性的时代。进入21世纪，HPLC在多个方面取得突破：Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、高通量的分析。2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破，Corona™带电气溶胶检测器（CAD）诞生，新一代的通用型检测器。2005年，岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。二、色谱法定义、分离基础和目的定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。图例分离基础：差速迁移(例:赛跑)目的：多组分分离，实现定性定量分析图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开碳酸钙吸附剂石油醚流动相色素三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间很长。高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较见下表方法项目高效液相色谱法经典液相色谱法色谱柱：柱长/cm柱内径/mm10~252~1010~20010-~50固定相粒度：粒径/μm筛孔/目5~502500~30075~600200~30色谱柱入口压力/MPa2~200.001~0.1色谱柱柱效/（理论塔板数/m）2×103~5×1042~50进样量/g10-6~10-21~10分析时间/h0.05~1.01~202.HPLC与GC的比较高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析，此两种方法的比较如下：不同色谱方法适用的分子量范围方法缩写方法全称分子量范围能检测的有机化合物的比重GPC凝胶渗透色谱＞10380—85%HPLC高效液相色谱法400--2000GC气相色谱法10—40015—20%2.HPLC与GC的比较分析对象及范围流动相的选择操作条件GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小加温常压操作HPLC溶解后能制成溶液的样品，高沸点、高分子量、难气化、离子型的稳定或不稳定化合物，占有机物的80%流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。室温、高压下进行相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测与经典液相色谱法相比颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。四、高效液相色谱法的特点与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析分析速度快——几~几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固体物质对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)按分离机制分类：分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法第二节HPLC分类基本类型色谱法的分离机制对于不同的分离机理，K的含义不同。吸附色谱吸附系数分配色谱分配系数离子交换色谱离子交换系数统称K分子排阻色谱分子排阻系数1.吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。3.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.空间排阻色谱（凝胶色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；（一）吸附色谱法要求：固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3）具表面活性吸附中心分离机制：见图示吸附系数mmaanamnmaaVXSXYXYXK]][[]][[的浓度为溶质分子在流动相中面的浓度为溶质分子在吸附剂表][][maXX为流动相的体积为吸附剂表面面积maVS注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关next吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开back（二）分配色谱法要求：固定相→机械吸附在惰性载体上的液体流动相→必须与固定相不为互溶载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示分配系数mmssmsVXVXCCK注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温有关next的浓度为溶质分子在流动相中的浓度为溶质分子在固定相中msCC为流动相的体积为固定相的体积msVV图示分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离连续萃取过程back分配色谱法分类正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性正相分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）反相分配色谱：极性强的组分先出柱。（三）离子交换色谱法要求：固定相→离子交换树脂流动相→水为溶剂的缓冲溶液被分离组分→离子型的有机物或无机物分离机制见图示选择性系数阳离子交换树脂RSO3-H++X+→RSO3-X++H+mSSmSmSSHHRSOXXRSOXHRSOHXRSOK][][][][][][][][3333注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关next固定离子可交换离子待测离子图示分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离back（四）空间排阻色谱法要求：固定相→多孔性凝胶流动相→水——凝胶过滤色谱流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱分离机制见图示渗透系数][][mSPXXK注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关next图示分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离back结论：四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响按固定相的固定方式分：平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱•按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类：–洗脱法–前沿法–置换法洗脱法（elutionmethod）又称淋洗法，将含有不同组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱。前沿法（frontalmethod）又称迎头法，如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个组分和第一个组分混合一起流出。此法仅第一个组分的纯度较高，其他流出物