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梅毒螺旋体抗体检测（TPPA）（凝集法）1.目的：规范实验室TPPA检测操作。2.范围：xxx院xxx科3.测定原理：将梅毒螺旋体（Nichols株）的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上。这种致敏粒子和样本中的梅毒螺旋体抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应（ParticleAgglutinationTest,PA法）由此可以检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体抗体，并且用来测定抗体的效价。4.标本：4.1采用正确医用技术收集血清/血浆样本，血浆样本推荐使用肝素钠抗凝血浆，枸橼酸钠和EDTA抗凝剂。4.2样本中的沉淀物和悬浮物，红细胞等其它有形成分可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用。4.3严重溶血或脂血的样本不能用于测定。4.4样本收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2~8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。4.5血清样品即使钝化也不会影响检测结果。5.试剂：珠海丽珠试剂股份有限公司提供的试剂。5.1试剂盒在2℃—10℃储存，防止冷冻，避免强光照射，有效期12个月。5.2试剂盒开启使用后，冷冻干燥品配好后，2℃—10℃保存可使用7日，使用前必须做对照试验。5.3试剂组成5.3.1溶解液（液体）：用于调制致敏粒子和未致敏粒子。5.3.2血清稀释液（液体）：用于样品的稀释。5.3.3致敏粒子（冷冻干燥）：调制浓度为1%的梅毒螺旋体（Nichols株）致敏明胶粒子。5.3.4未致敏粒子（冷冻干燥）经单宁酸处理调制浓度为1%的明胶粒子。5.3.5阳性对照血清（液体）用抗梅毒螺旋体（Nichols株）家兔免疫血清调制成抗体效价为1：320(最终稀释倍数)。6.临床标本测定6.1试剂的调制6.1.1溶解液（液体）：按照测定操作规则使用。6.1.2血清稀释液（液体）：按照测定操作规则使用。6.1.3致敏粒子（冷冻干燥）：加入一定量的溶解液进行调制。请在使用前30分钟于室温（15~30℃）下进行调制。6.1.4未致敏粒子（冷冻干燥）：加入一定量的溶解液进行调制。请在使用前30分钟于室温（15~30℃）下进行调制。6.1.5阳性对照血清（液体）：按照操作规则使用。6.2手工操作步骤6.2.1用微量滴管将血清稀释液滴入微量反应板第1孔中，共计4滴（100ul），从第2孔至第4孔各滴入1滴（25ul）。6.2.2用微量移液管取样品25ul至第1孔中，然后用微量加样器或微量移液管以倍比稀释的方式从第1孔稀释至第4孔中。6.2.3用试剂盒中提供的滴管在第3孔中加入1滴(25ul)未致敏粒子，在第4孔中加入1滴（25ul）致敏粒子。6.2.4用平板混匀器以不会导致微量反应板中的检测物溅出的强度混合30秒钟，加盖后于室温（15~30℃）下水平静置。2小时后，在观察镜上记录并观察其反应图像，即使静置至次日也不影响结果的判定。第1孔第2孔第3孔第4孔血清稀释液样品10025252525252525样品稀释倍数1:51:101:201:40未致敏粒子（ul）25致敏粒子（ul）25最终稀释倍数1:401:80进行混合，盖上盖子后静置反应2个小时判定结果6.3对照试验6.3.1能够确认每例样品未致敏粒子的反应（最终稀释倍数1:40）均是（-）6.3.2能够确认每次检查中血清稀释液和致敏粒子以及未致敏粒子的反应均是（-）（介质对照）。6.3.3每个试剂盒中的阳性对照血清都要与样品用相同的测定方法进行试验，阳性对照血清调制成抗体效价为1：320（最终稀释倍数）。6.4吸收操作对于未致敏粒子和致敏粒子均显示（±）以上的凝集样品，要按照下列顺序在完成吸收操作的基础上进行再试验。6.4.1取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子0.95ml至小试管中。6.4.2加入样品50ul混合，于室温（15~30℃）下放置20分钟以上。6.4.3离心分离（2000rpm，5分钟），然后分取上清液【吸收完毕的稀释样品（1:20）】50ul至反应板第3孔中，特别注意不要混入粒子。6.4.4从第4孔以后，要预先各滴入25ul血清稀释液，从第3孔至最后一孔用微量加样器倍比稀释。以后就与检验方法中同样的操作后进行判定。通常情况下可以用上述的吸收操作吸收完全，但如果吸收不干净时，请用其他的检测方法。7.性能指标:7.1特异性试验：自存标准样品按规定进行试验时，阳性标准样品的抗体效价相对于标准值在±1管以内，阴性标准样品在1:80(最终稀释倍数)下不会显示凝集图像。7.2灵敏度试验：试剂盒中带有的阳性对照血清按规定进行试验时，抗体的效价相对于标准值（最终稀释倍数1:320）在±1管内。7.3重复性试验：对同一样品（最终稀释倍数在1:160以上）重复进行5次测定，各抗体效价最大频数在±1管以内。7.4相关性：取样品391例，研究它们和对照品（间接红细胞凝集反应）的一致率，结果在±1管以内的一致率为100%。8.方法的局限性:8.1由于抗原，抗体反应的血清学试验方法的检测灵敏度具有一定的局限性，所以本试剂检测结果只能提示血清或者血浆中有无梅毒螺旋体抗体的存在，而不能作为临床诊治的唯一标准。8.2抗体测试阴性的样品并不能排除梅毒感染的可能。9.检测结果的解释9.1反应图像的判定在判定用观测板上静置微量反应板，观察粒子的反应图像。将反应图像与介质比照的图像进行比较，并参考下表进行判断。反应图像判定粒子成纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形（-）粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形（±）粒子形成明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱的凝集在周围（+）产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈现膜状延展（++）9.2判定基准阳性：未致敏粒子（最终稀释倍数1:40）的反应图像判定为（-）。致敏粒子（最终稀释倍数1:80以上）的反应图像判定为（+）时，最终判定为阳性。阴性：无论未致敏粒子呈现何种反应图像，只要致敏粒子（最终稀释倍数1:80）的反应图像显示为（-）时，最终判定为阴性。保留：未致敏粒子（最终稀释倍数1:40）的反应图像判定为（-），且致敏粒子（最终稀释倍数1:80）的反应图像判定为（±）时，最终判定为保留。10.注意事项10.1操作前仔细阅读使用说明书，严格按照试剂盒说明书进行试验操作。10.2避免在恶劣的环境（如含有84消毒液、次氯酸钠、酸碱或乙醛等高浓度腐蚀性气体及灰尘的环境）条件下进行试验。10.3用本试剂判定结果为保留时，请用其他的检测方法进行检测。10.4本试剂是用来测定样品中的梅毒螺旋体的抗体效价，不是用来测定梅毒螺旋体。在判定为抗体阳性的情况下，请结合其他的检查结果以及临床症状来进行综合判定。10.5样本中若存在沉淀物、悬浮物等可见杂质会影响试验结果。此类样本不得使用。10.6梅毒螺旋体感染早期，有可能不产生抗体，或者产生很少量的抗体。如果坏意感染，即使本试剂的判定结果为阴性，也要经过一段时间再进行检查并且于其他检查的结果和临床症状结合起来综合判定。10.7试剂需在有效期内使用。剩余试剂要及时密封，放置2~8℃条件下贮存。10.8血清免疫反应要注意前区现象。10.9服用含有免疫球蛋白血液制品的患者样品中，由于可能因服用制剂所致的阳性反应。要注意判定。10.10本试剂的溶解液，血清稀释液和阳性对照血清中含有0.1%的叠氮钠防腐剂，在废弃时要用大量的水冲洗，避免生成具有爆炸性的金属叠氮钠。10.11不同批号的试剂绝对不能混用。11.临床意义梅毒是梅毒螺旋体（Treponemapallidum，TP）引起的一种性传播疾病，人是梅毒螺旋体的唯一宿主。梅毒具有较强的传染性和慢性复杂的病理，它几乎可以引起全身所有系统的组织和脏器的损害及病变，导致功能失常，组织破坏，乃至死亡。2009年，梅毒报告病例数在我国甲乙类传染病报告中居第三位，其病程漫长，危害严重，早期侵犯生殖器和皮肤，晚期侵犯全身各器官，尤其是心血管和中枢神经系统。TP不仅严重损害成人身体的健康，同时还可由母体经胎盘垂直传播给胎儿，侵犯胎儿肝、脾、肾上腺、牙齿、骨骼、眼及脑神经等全身器官系统，引起早产、流产、死胎、畸胎、或胎传梅毒儿（又称先天性梅毒），严重影响出生人口质量。梅毒螺旋体抗体是梅毒感染人体后由免疫系统产生的特异性抗体，是梅毒感染的特异性指标。12.安全防护措施及处理：12.1按要求穿白大褂，带一次性手套。12.2处理试剂和样本时需戴一次性手套，操作后应彻底洗手。所有样本及使用后的试剂盒应视为潜在的传染性物质，废弃处理时，按照当地政府和有关国家规定进行。12.3如果发生污染，视污染范围，部位选择合适的处理方法（以下浓度84消毒液均由原液配置成）：12.3.1血液标本污染台面，用7000mg/L的84消毒液浸泡抹布，擦拭污染区域，小心处理容器碎片，消毒后置于利器盒内12.3.2血液标本溅洒在白大褂上，应脱去衣物，并用300mg/L的84消毒液消毒。12.3.3血液标本溅洒在眼睛上，应立即用洗眼器冲洗眼部15min后，上报主任，并去眼科就诊。12.3.4血液标本在离心机内破损，应在第一时间停止离心机运行，待其完全停止后，等30min内部气溶胶散去，并带口罩后，用7000mg/L的84消毒液浸泡抹布，擦拭污染区域，小心处理容器碎片，消毒后置于利器盒内13.相关记录文件试剂出库记录14.参考资料梅毒螺旋体抗体检测试剂盒（凝集法）使用说明书编者：审核：批准：批准时间：年月日