微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证

GMP文件—微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证第1页共8页题目微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证类别技术标准编码STP-WJ001-02版次第1版制定人审核人批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量部发布日期生效日期分发部门制定依据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》变更历史起草■修订□原编码：变更原因《药品生产质量管理规范》变更目的：本试验通过对微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制方法、灭菌程序以及配制后贮存条件和贮存效期进行验证，确保每次配制的培养基质量均满足2010年版《中国药典》要求。适用范围：适用于微生物限度检查用及环境监测用培养基。责任人：质监部经理、QC主任、QC人员内容：1.概述：3次独立试验中确定了培养基的配制方法、灭菌参数、贮存条件（2-25℃）及贮存时间（30天），并对贮存0天、7天、15天和30天的培养基进行适用性检查(包括促生长能力、抑制能力、指示能力和无菌性)。培养基是否合格，对微生物的生长、分离、鉴定及检验结果的正确与否起着至关重要的作用，因此，对培养基的质量控制十分必要。适宜的培养基制备方法，合理存放，以及质量控制试验，是提供优质培养基的保证。2005年版《中国药典》还没有规定对培养基进行适用性检查，经过修订，2010年版《中国药典》不但规定了培养基需进行适用性检查，而且在2010年版《中国药典》（一部附录）中规定：“若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查实验可只进行一次，如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验”。本次验证试验的目的就是通过验证规范培养基的配制和灭菌过程，使培养基的整个配制和灭菌过程受控，同时确定培养基的贮存条件和贮存效期。2.材料与仪器设备2.1培养基2.1.1.试验用培养基：营养琼脂培养基（批号121010）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号1302172）、胰酪胨大豆琼脂培养基（批号1112092）、胆盐乳糖培养基（批号1209162）、营养肉汤培养基（批号120912）、四硫磺酸钠亮绿培养基(批号130124)、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（批号121023）均由北京三药科技开发公司生产；2.1.2.对照培养基：营养琼脂对照培养基（批号135003-201103）、玫瑰红钠琼脂对照培养基（批号135005-201002）、胰酪胨大豆琼脂对照培养基（批号135025-201101）、胆盐乳糖对照培养基（批号135006-201203）、营养肉汤对照培养基（批号135004-201103）、四硫磺酸钠亮绿对照培养基(批号135020-201101)、4-甲基伞形酮葡糖苷酸对照培养基（批号135012-201001）均中国药品生物制品检定所提供。GMP文件—微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证第2页共8页2.2.菌种大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕；金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕；乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）〔CMCC（B）50094〕；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕；白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕；黑曲霉（Aspergillusniger）〔CMCC（F）98003〕］以上菌种均购自贵州省食品药品检验所。2.3.仪器设备医用型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；标准型洁净工作台（苏州净化设备厂）；电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械一厂）；生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；JJ200型电子天平（常熟双杰测试仪器厂）；立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；电热恒温水浴锅（天津市泰特仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；漩涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；格兰仕微波炉（顺德市微波炉电器有限公司）；电冰箱（河南新飞电器有限公司）。3.方法和结果3.1.试验环境试验在洁净度为A级的单向流空气的洁净操作台进行，其环境洁净度为C级。检验过程严格遵守无菌操作。3.2.培养基的配制方法和灭菌参数3.2.1.培养基的选择：分别随机抽取接近效期的脱水培养基各3瓶，按照2010年版《中国药典》培养基适用性检查中规定的方法，试验分别进行3次独立试验，每次从培养基中各选取1瓶进行试验。3.2.2.配制方法：按照培养基包装上的配制说明配制，将培养基分别分装在锥形瓶中，用硅胶塞塞紧瓶口，并用硫酸纸包扎。四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）分装于试管中，10ml/管，包扎；MUG分装于试管中，5ml/管，包扎。2.2.3灭菌参数：配制、包扎好的培养基，装入立式压力蒸气灭菌器中，以验证的灭菌程序进行灭菌，灭菌后测pH值。3.3.灭菌后培养基的贮存和贮存后使用方法3.3.1.贮存条件：灭菌后的培养基放冷后，置于2-25℃冷藏柜密闭贮存30天，每天记录冷藏柜温度。3.3.2.贮存后的使用方法：灭菌贮存后的已经凝固的固体培养基，使用前，先于微波炉中融化，待培养基完全融化后，置于45℃左右的恒温水浴锅中，待培养基温度达到45℃后使用；灭菌贮存后的液体培养基可直接使用。3.3.3.贮存时间、适用性检查项目和试验菌种：分别选取灭菌后贮存0天（即刚灭菌后未凝固的培养基）、7天、15天、30天后的培养基进行适用性检查，检查项目和试验菌种见表1。GMP文件—微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证第3页共8页表1各类培养基的适用性检查项目培养基名称(英文缩写)检查项目试验菌种无菌性促生长能力抑制能力指示能力营养琼脂培养基(NA)√√××大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌玫瑰红钠琼脂培养基(RBA)√√××白色念珠菌黑曲霉大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）√√××大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)√√×√大肠埃希菌MUG培养(MUG)√√×√大肠埃希菌乳糖胆盐培养基(BL)√√√×大肠埃希菌金黄色葡萄球菌营养肉汤培养基√√××乙型副伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）√√√×乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌注：√为考察项；×为不考察项。3.4.菌悬液的制备参照2010年版《中国药典》附录中的方法制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和乙型副伤寒沙门菌的菌悬液，用无菌的0.9%氯化钠溶液制成1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。并用营养琼脂对照培养基测定各试验组中加入的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和乙型副伤寒沙门菌的数量。用玫瑰红钠琼脂对照培养基测定各试验组中加入白色念珠菌、黑曲霉的数量。3.5.培养基适用性检查的试验方法及结果3.5.1.营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基促生长能力检查：按照表1中的检查项目，取上述制备的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液各1ml（含菌数50～100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注对应的被检培养基和和对照培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（2个被检培养基和2个对照培养基），混匀，凝固后，营养琼脂培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基置30～35℃培养48h；玫瑰红钠琼脂培养基置23～28℃培养72h；培养结束后各平板平均菌落数。从表2可以看出，3次试验中3种试验菌在被检营养琼脂培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基上的平均菌落数和2种试验菌在被检玫瑰红钠琼脂培养基的平均菌落数均不小于相应对照培养基上菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。3.5.2.EMB固体选择性培养基促生长能力和指示能力检查：GMP文件—微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证第4页共8页分别取大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的菌悬液0.1mL（含菌数10-100cfu，测定结果见表3）涂布于被检EMB平板上，在30～35℃培养18h。从表4可以看出，3次试验中试验菌在被检培养基上生长良好，其菌落大小、形态特征、指示反应情况均符合大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的典型特征。3.5.3.MUG液体培养基促生长能力和指示能力检查：取大肠埃希菌菌悬液1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）接种到5ml被检MUG中，MUG在30～35℃培养5h后观察现象，结果3次试验中试验菌在两种被检液体培养基中生长良好，培养基变浑浊，于365nm紫外光下呈现荧光反应，见表4。3.5.4.BL液体培养基促生长能力和抑制能力检查：取大肠埃希菌菌悬液1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）接种到1瓶100ml被检BL中，置30～35℃培养18h后观察现象；取金黄色葡萄球菌菌悬液2ml（不少于100cfu，测定结果见表3）接种到另1瓶100ml被检BL中，置30～35℃培养24h后观察现象，结果（见表4）。3次试验中大肠埃希菌在被检培养基中生长良好，培养基变浑浊；金黄色葡萄球菌在被检培养基中被抑制，不生长，培养基澄清。3.5.5.营养肉汤培养基促生长能力检查：取乙型副伤寒沙门菌菌悬液1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）分别接种到100ml被检营养肉汤培养基和对照营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18h后，与对照培养基比较；3次试验中乙型副伤寒沙门菌在被检培养基中生长良好，培养基变浑浊；培养48h后，空白培养瓶澄清。3.5.6.四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）促生长能力和抑制能力检查：取5支（10ml/支）的对照TTB培养基，分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌菌悬液1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）各2支，另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置30～35℃培养18h后，与对照培养基比较；3次试验中乙型副伤寒沙门菌在被检培养基中生长良好，培养基变浑浊；培养24h，空白的培养管和接种金黄色葡萄球菌的培养管澄清。3.5.7.无菌检查试验：培养基灭菌后，不接种任何样品，在对应的培养条件下培养。从表3和表4中各培养基的无菌性可以得出，固体培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基和EMB）无菌落生长；液体培养基（营养肉汤、BL、四硫磺酸钠亮绿培养基和MUG）澄清，与空白对照一致，均满足无菌要求。GMP文件—微生物限度检查用及环境监测用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证第5页共8页表2营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基适用性检查结果组次贮存时间营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基大豆酪蛋白琼脂培养基促生长能力检查无菌性检查促生长能力检查无菌性检查促生长能力检查被检培养基平均菌落数(cfu)/对照培养基平均菌落数(cfu)/菌液回收率被检培养基平均菌落数(cfu)/对照培养基平均菌落数(cfu)/菌液回收率被检培养基平均菌落数(cfu)/对照培养基平均菌落数(cfu)/菌液回收率无菌性检查大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌10天81/84/96%70/73/96%83/84/99%（-）63/67/94%51/54/94%（-）81/86/94%74/75/99%74/75/99%（-）7天64/71/90%78/84/93%70/72/97%（-）62/73/85%59/64/92%（-）81/86/94%80/81/99%80/81/99%（-）15天70/73/96%81/86/94%74/75/99%（-）55/56/98%53/59/90%（-）94/95/99%68/60/113%65/70/93%（-）30天83/92/90%74/81/91%81/86/94%（-）69/73/95%62/63/98%（-）82/78/105%71/74/96%76/77/99%（-）20天70/77/91%79/83/95%73